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中药对镍暴露氧化损伤抑制作用
作者：吕晓云，蒲晓丽，陈静，朱玉真，赵健雄，魏虎来
【摘要】 目的 研究灌服扶正解毒汤(FJD)后兔血清对硫酸镍(NiSO4)暴露的人支气管上皮细胞(16HBE)自由基含量及8?羟基?2?脱氧鸟苷三磷酸酶(8?oxo?dGTPase)表达的影响。方法 体外培养的16HBE细胞分别经NiSO4暴露及NiSO4加扶正解毒汤含药血清共同处理后，采用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)及实时荧光定量RT?PCR检测自由基含量及8?oxo?dGTPase表达的变化。结果 NiSO4(800μmol/L)暴露的16HBE细胞，其自由基含量及8?oxo?dGTPase表达水平均高于NiSO4与扶正解毒汤(10%)共处理组细胞，Ｐ＜0?05～0?01，相对标准偏差(RSD)＞2%。结论 8?oxo?dGTPase可作为镍暴露氧化应激的标记物；中药扶正解毒汤通过清除自由基，下调8?oxo?dGTPase的表达，对镍暴露氧化损伤具有显著的抑制作用。
【关键词】 扶正解毒汤
本课题组多年进行的体内实验及职业病研究表明，中药扶正解毒汤(FJD)具有良好地拮抗镍毒性的作用〔1，2〕。本文从体外途径研究了中药解毒汤对硫酸镍(NiSO4)暴露的人支气管上皮(16HBE)细胞内自由基含量及8?羟基?2?脱氧鸟苷三磷酸酶(8?oxo?dGTPase)表达的影响，旨在为该复方的作用机制补充新的资料。
1 与方法
1?1 材料
1?1?1 细胞及动物16HBE细胞(美国ATCC公司)。纯种青紫兰兔8只，雄性，体重(2?1±0?3)kg(中国兰州生物制品研究所)，合格证号：14?004，常规饲养。
1?1?2 中药 扶正解毒汤由红芪、当归、丹参、枸杞等组成，以三蒸水煎煮，过滤、浓缩成含生药4g/ml的溶液，高温高压消毒灭菌，密封，4℃以下储存备用。
1?1?3 主要试剂及设备 基础培养液(MEM)培养基、Trizol试剂盒(美国GIBCO公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；乙酰乙酸盐?2，7?二氯氢化荧光素(D?399)(美国Molecular Probes公司)；ExScripＴＭRT reagent Kit及SYBR? Premix Ex TaqTM试剂盒(日本TaKaRa公司)；TCS sp2型激光扫描共聚焦显微镜系统(德国Leica公司)；Smart Cycler ⅡSystem荧光定量PCR仪(美国PE公司)。人类human NutT homologue (hMTH1)基因PCR引物设计参照文献〔３〕。分别为P1：5′?CTTCTCTGCGCCACTCAA?3′，P2：5′?GAGCGGCGGTGCAGAACC?3′；预计扩增片段177bp。β?actin引物为P1：5′?TTGCGCTCAGGAGCAAT?3′，P2：5′?TTCCAGCCTTCCTTCCTGG?3′；预计扩增片段223bp(宝生物工程有限公司合成)。
1?2 方法
1?2?1 扶正解毒汤血清冻干粉制备 以中药扶正解毒汤12g/kg每天分2次给兔等体积灌胃，空白对照组予以生理盐水(灌胃前均禁食，自由取水)，共3d。于末次灌胃后2h心脏采血，按文献〔4〕方法制备扶正解毒汤血清及空白血清冻干粉。
1?2?2 细胞培养及受试物处理 16HBE细胞用含10%小牛血清、青霉素及链霉素的MEM培养基于37℃，5%CO２饱和湿度的中培养。试验时以不含小牛血清的MEM培养液将细胞调至1×104/ml，按以下分组分别处理：(1)NiSO4组：NiSO4以无血清MEM培养液溶解，终浓度800μmol/L(预试验中，NiSO4≥800μmol/L时，细胞存活率骤降至60%以下，故以800μmol/L作为此试验浓度)。(2)扶正解毒汤+NiSO4Ⅰ组：NiSO4染毒前4h加入扶正解毒汤血清，终浓度为10%(体积分数)，再加入NiSO4(800μmol/L)。(3)扶正解毒汤+NiSO4Ⅱ组：同时加入扶正解毒汤与NiSO4。(4)空白血清对照(简称空白血清)+NiSO4组：同时加入空白血清与NiSO4。终浓度均同(2)。(5)空白血清组：加入空白血清(10%)。(6)阴性对照组：MEM培养液。
1?2?3 细胞存活率检测 以常规台盼蓝计数法检测各组细胞存活率，每组共计数250个细胞。
1?2?4 细胞内自由基含量检测 在加入NiSO416h后，将收集的各组细胞制成细胞悬液，取D?399(5μg/ml)1ml，加至各细胞悬液中，按文献〔5〕方法以激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测16HBE细胞内自由基含量(以平均荧光强度表示)。
1?2?5 RNA提取、cDNA合成及标准定量模板的制备 在进行自由基含量测定的同时，另收集各组细胞，按Trizol试剂盒说明，提取各组总RNA，测定A260，A280的吸光度值，计算出RNA的含量，并按ExScriptTMRT reagent Kit操作说明逆转录合成cDNA,置于-80℃保存备用。将宝生物工程有限公司构建的hMTH1及β?actin定量PCR标准品质粒利用各自的引物进行RT-PCR扩增，制备6个不同浓度的标准模板，分别定义为101～106拷贝数/μl，-20℃保存备用。
1?2?6 SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应 根据SYBR? Premix Ex TaqTM试剂盒说明，设定反应扩增条件，将6组实验样品与不同浓度的标准模板同时进行PCR。重复3次。将检测的临界点设定在扩增过程中，荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数(threshold cycle,CT)作为模板初始浓度的间接指标，将不同浓度的标准模板拷贝的对数相应的CT值作图，得到标准曲线。
1?2?7 8?oxo?dGTPase(hMTH1 mRNA)表达的相对定量分析 将得到的各组hMTH1基因及β?actin基因的值分别代入各自的标准曲线，换算出各自的起始模板量。以β?actin作为参比基因对所有样品进行RNA校正，用hMTH1基因的定量结果除以β?actin定量结果即可得到校正值。以阴性对照组hMTH1 mRNA的表达量作为“1”，再根据校正值计算出其他各组的相对量，进行组间相对量的比较。
1?3 分析 采用SPSS 10?0统计软件进行分析；组间差异用t及相对标准偏差(RSD)检验(以RSD＞2%为差异有统计学意义)。
2 结果
2?1 细胞存活率 经台盼蓝计数，各组的细胞存活数均不低于90%，且差异无统计学意义。
2?2 LSCM检测结果(表1，图1A～Ｃ) NiSO4染毒后16h，细胞D?399平均荧光强度(自由基含量)明显增强，扶正解毒汤血清与NiSO4共处理各组D?399平均荧光强度显著低于NiSO4组(Ｐ＜0?05～0?01)；空白血清对染镍细胞内自由基含量变化无影响。
表1 扶正解毒汤血清对染镍16HBE内自由基含量变化的影响（略）
注：与阴性对照组比较，a Ｐ＜0?05；与NiSO4组比较，b Ｐ＜0?05，c Ｐ＜0?01
A：NiSO4组 B：扶正解毒汤+NiSO4(Ⅰ)组 C：扶正解毒汤+NiSO4(Ⅱ)组
图1 LSCM下16HBE细胞内D?399荧光强度(×40)（略）
2?3 实时定量PCR反应的标准曲线分析 hMTH1和β?actin定量标准曲线的斜率分别为-1?0388和-1?1021，r2分别为0?9990和0?9966。表明线性关系良好，在实验浓度范围内能够进行准确定量。
2?4 扶正解毒汤血清对染镍细胞８?oxo?dGTPase(hMTH1 mRNA)表达的影响(表2) 与阴性对照组比较，NiSO4染毒组细胞８?oxo?dGTPase表达明显增强(RSD=5?8%)，且空白血清对此结果无影响；而扶正解毒汤+NiSO4Ⅰ组、扶正解毒汤+NiSO4Ⅱ组细胞８?oxo?dGTPase表达水平则明显低于NiSO4组(RSD分别为6?7%，6?3%)。
3 讨论
８?oxo?dGTPase由hMTH1基因编码，可催化DNA氧化损伤产物8?羟基?2?脱氧鸟苷三磷酸(８?oxo?dGTP)的水解，从而阻止后者向DNA的错误掺入，减少突变。故被视为一种内源性抗氧化、抗突变酶〔6〕，又可作为一种氧化应激的标记物〔3〕。镍化合物可通过诱导氧化应激等途径产生一系列细胞遗传毒性，甚至癌变〔7，8〕。本研究发现，NiSO4(800μmol/L)暴露16HBE细胞16h，其自由基含量及８?oxo?dGTPase表达均明显增强，间接证实了镍暴露16HBE细胞内氧化应激的存在，同时也证明了８?oxo?dGTPase作为氧化应激标记物的作用。16HBE细胞经扶正解毒汤血清与NiSO4共同处理后，其自由基明显降低，而８?oxo?dGTPase的表达水平则无明显增加。提示扶正解毒汤可能通过或直接清除方式而减少染镍细胞内自由基的产生，发挥体外抗氧化作用，此与体内实验结果一致〔９，１０〕。同时亦可认为，扶正解毒汤与NiSO4共处理组细胞内８?oxo?dGTPase表达的下调，并非扶正解毒汤血清直接作用的结果，而正是由于扶正解毒汤对ROS迅速而有效的清除，使得该氧化应激标记物的“预警”效应处于低或不应答状态，从而反证了扶正解毒汤的抗氧化作用。有关扶正解毒汤抗镍暴露氧化损伤的具体机制还需进一步探讨。
表2 不同处理组细胞hMTH1 mRNA表达的相对量比较（略）
注：与阴性对照组比较，a RSD=5?8%；与NiSO4组比较，b RSD=6?7%，c RSD＝6?3%
【参考文献】
〔1〕 赵健雄，宁守斌，朱玉真，等.中药防治硫酸镍致肝肾损伤实验研究［J］.卫生毒杂志，2004，14(4)：240-241.
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