矽肺模型大鼠肺间质成纤维细胞MMP
作者：王海涛，刘昊，颜京霞，田艳霞，江小华，高俊玲
【关键词】 肺间质纤维化
Expression of matrix metalloproteinase2 and 9 in pulmonary fibroblasts of silicotic fibrosis rat model
【Abstract】 AIM: To study the expression of MMP2 and MMP9 in fibroblasts of rat silicotic fibrosis model and its significance. METHODS: Fifty pathogenfree Wistar rats were randomly divided into experimental group and control group. Experimental group was instillated with SiO2, while control group with normal saline. Pulmonary interstitial fibroblasts were isolated on day 1, 3, 7, 14 and 28 after SiO2 exposure. The protein and mRNA expression of MMP2 was evaluated by immunocytochemistry and RTPCR. RESULTS: ①The MMP2 protein expression in fibroblasts increased on day 1 after SiO2 exposure and reached 3.887 times（t=23.667，P<0.001） that of control group on day 7. The expression of MMP9 protein also increased on day 1 after SiO2 exposure and reached 3.103 times that of control group（t=11.399, P<0.001）on day 7. ② The mRNA expression of MMP2 and MMP9 was enhanced in fibroblasts at 24 h after SiO2 instillation. CONCLUSION: The expression of MMP2 and MMP9 in fibroblasts is upregulated in silicotic fibrosis model.
【Keywords】 matrix metalloproteinase; fibroblast cells; pulmonary fibrosis; silicotic fibrosis
【摘要】 目的:探讨肺间质成纤维细胞MMP2和MMP9在SiO2致肺纤维化中的表达及意义. 方法: 清洁级Wistar大鼠50只，随机分为对照组和实验组，实验组气管内注射SiO2悬液，对照组代以等剂量生理盐水. 注射后1，3，7，14和28 d分离和提取肺间质成纤维细胞，应用免疫细胞化学和逆转录多聚酶链式反应（RTPCR）方法，观察其MMP2，MMP9蛋白及其mRNA的动态变化. 结果:①SiO2作用后1 d成纤维细胞MMP2表达增高，7 d达高峰，为对照组的3.887倍（t=23.667，P<0.001）；MMP9在SiO2作用后1 d表达增高，7 d达对照组的3.103倍（t=11.399，P<0.001）；②MMP2 mRNA和MMP9 mRNA的转录从SiO2作用后1 d就开始升高. 结论:受SiO2刺激后，肺间质成纤维细胞上调MMP2和MMP9的表达，损伤肺泡基底膜，启动肺纤维化的发生.
【关键词】 基质金属蛋白酶；肺间质成纤维细胞；肺间质纤维化；矽肺
0引言
基质金属蛋白酶及其组织抑制物（matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, MMP/TIMP）是肺纤维化效应细胞分泌的生物活性分子，在细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成和降解中具有重要意义. 在MMP家族中，MMP2和MMP9的特异性底物主要是Ⅳ型胶原，而后者是肺泡壁基底膜的重要成分. 肺泡上皮细胞和基底膜的损伤是肺间质纤维化过程的关键事件［1］. 我们在SiO2所致肺纤维化形成过程中的不同阶段分离肺成纤维细胞（lung fibroblast,LFb），应用免疫细胞化学和逆转录多聚酶链式反应（RTPCR）对MMP2和MMP9蛋白及其mRNA进行探讨如下.
1和方法
1．1材料
健康雄性SD大鼠，体质量（180±40）g，由华北煤炭院医学实验动物中心提供. SiO2粉尘（中国医学科学院劳卫所）；小鼠抗波形蛋白（vimentin） mAb及免疫组化染色SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；羊抗MMP2和羊抗MMP9多克隆抗体（Santa Cruz产品）；免疫组化SP试剂盒（北京中山生物技术有限公司）；Trizol试剂盒（Gibco公司产品）；逆转录反应试剂盒（Takara公司产品）；PCR扩增试剂盒和DNA梯度Marker（Sangon公司）；引物由Sangon公司合成，PAGE纯化. MMP2引物序列为5′CTA TTC TGT CAG CAC TTT GG3′（sense），5′CAG ACT TTG GTT CTC CAA CTT3′（antisense），扩增片段长度为303 bp. MMP9引物序列为5′AAA TGT GGG TGT ACA CAG GC3′ （sense），5′TTC ACC CGG TTG TGG AAA CT3′（antisense），扩增片段长度为303 bp. 内参照采用GAPDH，引物序列为5′CTT CTG AGT GGC AGT GAT GG3′ （sense），5′TGG CAC AGT CAA GGC TGA GA3′（antisense），扩增片段长度为389 bp.
1．2方法
大鼠50只，随机等分为实验组和对照组. 实验组大鼠乙醚麻醉后，采用经气管染SiO2粉尘法复制矽肺模型［2］. SiO2粉尘悬液50 g/L，生理盐水配制，每只大鼠1 mL. 对照组在相同条件下气管内注入生理盐水1 mL. 染尘后1，3，7，14，28 d分别处死实验组和对照组各5只，无菌操作取肺. 采用酶消化法结合组织块贴壁培养法分离和培养细胞. 用SABC法检测细胞的波形蛋白（vimentin）的表达，以鉴定分离培养的细胞为肺间质成纤维细胞.
1．2．1免疫细胞化学检测MMP2和MMP9将第4代LFb接种于载玻片上，贴壁后，血清饥饿使其同步化，按照SP试剂盒说明，作细胞爬片的免疫细胞化学染色. 羊抗鼠MMP2一抗和羊抗鼠MMP9一抗1∶150稀释. DAB显色. PBS代替一抗作阴性对照. 染色结果经Motic Med 6.0数码医学图像分析系统（北航）作图像分析，胞质中的棕褐色颗粒为表达阳性，表达强度用积分吸光度（A）表示.
1．2．2RTPCR检测MMP2和MMP9 mRNA按照Trizol试剂盒说明提取细胞总RNA. 逆转录步骤参照说明书进行，反应条件42℃ 15 min，95℃ 2 min；PCR扩增反应步骤参照说明书，反应条件94℃，45 s；58℃，45 s；72℃，80 s；30个循环. 扩增产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳. 电泳条带采用凝胶成像系统做积分吸光度（A值）测定，以实验组和对照组MMP2, MMP9与GAPDH的A比值的表示MMP2 mRNA的相对表达量.
学处理： 数据以x±s表示，用SPSS 11.0统计软件包进行组间t，方差不齐时用t′检验.
2结果
2．1MMP2和MMP9的表达矽肺模型组大鼠LFb MMP2和MMP9表达比对照组明显增强，7 d为表达高峰(Tab 1, Fig 1).表1肺间质成纤维细胞MMP2, MMP9蛋白及mRNA表达的动态变化（略）
2．2MMP2和MMP9 mRNA的变化模型组LFb MMP2和MMP9 mRNA表达与对照组比较明显增高(Tab 1).
3讨论
长期吸入SiO2粉尘引起的矽肺，其主要病理改变是矽结节形成和间质纤维化, 但其发病机制尚未完全阐明. 目前认为,吸入SiO2粉尘后，肺泡巨噬细胞、中性粒细胞等分泌多种细胞因子，导致肺泡炎的发生发展，最终引起进行性肺间质纤维化. 纤维化的发生是细胞外基质合成与降解不平衡的结果. 近年来，细胞外基质降解系统尤其是基质金属蛋白酶及其组织抑制因子功能紊乱，在纤维化疾病中愈来愈受到重视. 研究表明，基质金属蛋白酶在细胞外基质的降解与重塑的病理生理发展过程中起关键性作用. MMP2和MMP9的.特异性底物是Ⅳ型胶原，而后者是肺泡壁基底膜的重要成分. 由致病因素引起的MMP2,MMP9高表达在破坏肺泡上皮细胞基底膜继而纤维母细胞侵入肺泡腔引起肺纤维化中起作用［3］. 动物实验和临床均表明，在肺纤维化中有MMP2和MMP9的高表达［4］.
本结果显示,注入SiO2粉尘后1 d MMP2蛋白表达即显著升高，达到对照组的1.245倍（t=2.660，P<0.05），7 d达到高峰，为对照组的3.887倍（t=23.667，P<0.01），28 d仍显著高于对照组（t=5.621，P<0.01）. 其mRNA表达亦明显增高. MMP9及其mRNA表达和对照组比较在1，3，7 d显著升高. 提示在肺间质纤维化早中期，肺间质成纤维细胞是MMP2和MMP9来源之一. 肺间质成纤维细胞可能通过高表达MMP2和MMP9，启动了介于炎症细胞之间、炎症细胞与肺组织