丁酸对树突状细胞免疫作用的影响
短链脂肪酸是维持肠道正常生理功能和肠道免疫稳态的重要因素，以下是小编搜集整理的丁酸对树突状细胞免疫作用探究的论文范文，供大家阅读参考。
人及动物肠道内的短链脂肪酸(Short-chainfat-tyacids,SCFAs)是肠道内正常微生物群的代谢产物，是维持肠道正常生理功能和肠道免疫稳态的重要因素。丁酸盐作为肠道内最丰富的、具有生物活性的短链脂肪酸，不但是小肠上皮细胞的营养因子，维持上皮细胞的生长[1,2],而且还能够阻止结肠癌细胞的细胞周期循环和诱导结肠癌细胞凋亡[3].
同时，作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histonedeacetylaseinhibitor,HDACi),丁酸盐也具有潜在的免疫调节作用[4].在细胞内，组蛋白乙酰化受组蛋白乙酰转移酶(Histoneacetyltransferases,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(Histonedeacetylases,HDACs)调节。组蛋白乙酰化能够引起细胞核染色质扩张，并且增强调控蛋白与DNA的亲和力，而组蛋白去乙酰化则会引起核染色质缩合和转录阻遏[5].HDACi对肿瘤细胞的效应已有明确报道。HDACi可通过改变基因的转录阻止肿瘤细胞的生长、分化，从而诱导细胞凋亡[6].近期的研究报道也表明，HDACi有抗血管增生和免疫调节的作用，可使一些免疫性疾病和炎性疾病的体征得到改善，如可很大程度缓解系统性红斑狼疮(SLE)的蛋白尿、肾小球肾炎等[7].
树突状细胞(DCs)是体内重要的抗原提呈细胞，在免疫系统中起重要的作用。鉴于DCs细胞表型与功能的可塑性，我们推测有去乙酰化酶抑制剂效应的代谢产物丁酸等短链脂肪酸可能具有调节DCs细胞特性的功能，并参与体内免疫稳态的维持。因此，本研究中以体外培养的骨髓源DCs细胞作为研究对象，探讨了丁酸对DCs细胞的免疫调节功能，并对其可能机制做了初步的探讨。
1材料与方法
1.1实验动物6~12周龄的雌性C57/BL6小鼠(购自扬州大学比较医学中心),6~12周龄的H2kb-OVA257-264肽抗原特异性的OT1小鼠购自JacksonLab后，本室繁育后用于实验。
1.2主要试剂和仪器丁酸钠盐(Sigma公司),高糖DMEM培养基、胎牛血清(PAA公司),6孔板、24孔板、96孔板(Nunc公司),脂多糖(LPS,Sigma公司),卵清蛋白(OVA,Sigma公司),总RNA提取试剂Trizol(TaKaRa公司),逆转录试剂盒(Invitrogen公司),SYBRGreen荧光染料(TaKaRa公司),CFSE荧光染料(Invitrogen公司),RIPA裂解液(TaKaRa公司),CD11b-FITC、CD11c-Biotin-cy5.5、CD80-PE、CD86-PE、MHC-Ⅱ-FITC、B7-DC-FITC、TLR4-Biotin-cy5.5、CD8-Biotin-cy5.5、CD8-PE(eBioscience公司),磁分选试剂盒(Stemcell公司),7-AAD(eBio-science公司),p-erk和t-erk抗体(eBioscience公司),超净工作台(苏州净化厂),二氧化碳培养箱(Forma公司),倒置式生物显微镜(Nikon公司),PCR仪(Bio-Rad公司),台式离心机(Thermo公司),CFX96定量PCR仪(Bio-Rad公司),FACSCal-ibur流式细胞仪或BDAccuriC6流式细胞仪(BD公司).
1.3小鼠骨髓源树突状细胞(BMDCs)的体外培养参照文献[8]进行。简述之，将C57/BL6小鼠处死后，取股骨与胫骨。用无菌PBS液冲洗骨髓腔，制备骨髓细胞。将骨髓细胞用含10%FCS、GM-CSF(10ng/ml)、IL-4(1ng/ml)的DMEM培养基在37℃、5%CO2条例下进行培养7d后，收获并纯化CD11c+细胞，作为不成熟BMDC细胞。将加入LPS(终浓度为1μg/ml)的细胞作为成熟BMDC细胞。
1.4丁酸对BMDCs膜表面共刺激分子和MHCⅡ的影响将诱导培养7d的BMDC细胞，按每孔5×105细胞加入到24孔板中，分别加入LPS或丁酸盐(终浓度0.5mmol/L)后继续培养18h.收集细胞，用大鼠血清封闭10min后，4℃条件下，将细胞液中分别加入荧光素标记的CD80、CD86、MHCⅡ和B7-DC等抗体，标记15min.将标记完成的细胞用PBS液洗二遍后，用流式细胞分析仪检测标记细胞的荧光信号，并用Flowjo软件分析。
1.5丁酸对BMDCs分泌IL-6、IL-12和NO的影响细胞的处理与准备同1.4.细胞处理完成后，加入TRIZOL裂解BMDC细胞，提取其总RNA.按照逆转录试剂盒说明书将2μgRNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板，以GAPDH为内参，定量检测扩增IL-6、IL-12基因的表达。所用引物序列如下：GAP-DH上游序列GGCATTGCTCTCAATGACAA,下游序列TGTGAGGGAGATGCTCAGTG;IL-6上游序列GAGGAGACTTCACAGAGGATAC,下游序列GACTCTGGCTTTGTCTTTCTTG;IL-12上游序列GGTTTGCCATCGTTTTG,下游序列GGGTCTTTC-CAGAGCCT.Real-timePCR反应体系：SYBRGreen5μl、上下游引物各0.2μl、cDNA模板0.5μl、ddH2O4.1μl,总反应体系为10μl.扩增条件：
95℃5s,58℃20s,72℃31s,39个循环。采用2-△△CT法计算相对基因表达。另外，收集18h后的各组上清，按照Griessreaction试剂盒说明采用酶标仪检测上清中NO2-的含量。
1.6丁酸对BMDCs激活抗原特异性CD8+T细胞增殖能力的评估细胞的处理与准备同1.4.将BMDCs用OVA抗原处理6h.另分离H2kb-OVA257-264肽抗原特异性OT1小鼠的脾脏，碾磨、破红细胞后用PBS洗一次。去上清，留余液混匀，将细胞转移到分选管，加CD8-Biotin-cy5.5抗体，室温15min;加试剂盒中BiotinSelectionCocktail,室温1管插入分选磁铁中，5min,弃去液体;加PBS混匀细胞，再重复分选二次。加PBS吹打混匀细胞，并转移至离心管，重悬细胞;加CFSE于37℃、10min进行细胞标记。将经OVA处理后的各组DC与经过CFSE标记的CD8+T细胞共培养，两者细胞比为2×104∶2×105,37℃、5%CO2条例下培养4d后，将细胞标记荧光抗体anti-CD8、7-AAD,流式细胞仪检测CD8+T细胞增殖情况。
1.7丁酸对LPS刺激的'TLR4信号通路ERK分子磷酸化的影响将诱导培养7d后的BMDC,按每孔5×105细胞加入到24孔板中，分别在0、15、30、60min时分别加入LPS或丁酸盐(终浓度0.5mmol/L)处理细胞，之后再加入RIPA裂解液提取蛋白，Westernblot检测各组中TLR4信号通路ERK分子的磷酸化。
1.8统计学分析实验数据用GraphPadPrism5.0软件分析处理。两组间比较采用t检验;多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1丁酸对BMDCs细胞膜表面分子的影响从图1可看出，相对于不成熟BMDCs,LPS刺激成熟的BMDCs细胞的膜表面分子CD80、CD86、MHCⅡ、B7-DC荧光信号强度出现右移，表达上调;但丁酸处理后可使这些膜表面分子的荧光信号强度又出现左移，表达下调。此结果说明丁酸能够抑制BMDCs细胞的成熟。但是，不成熟BMDCs组与丁酸盐/不成熟DC组间的结果显示，丁酸处理后不成熟BMDCs细胞表面的CD80、CD86、MHCⅡ、B7-DC表达没有明显改变。此结果提示丁酸对于成熟BMDCs细胞的表型有明显的抑制效应，而对于不成熟的BMDCs细胞并无明显影响。
2.2丁酸对BMDC细胞IL-6、IL-12和NO分泌的影响不成熟BMDCs组与LPS刺激成熟BMDCs组比较显示，成熟BMDCs分泌的细胞因子IL-6、IL-12(图2A)和NO(图2B)明显增加。但加入丁酸盐处理后，该BMDCs细胞对此类细胞因子和NO的分泌水平出现明显下降。此结果说明成熟BMDCs分泌的IL-6、IL-12、NO受到丁酸的抑制。但不成熟BM-DCs组与丁酸盐/不成熟BMDCs组间结果比较显示，BMDCs分泌的IL-6、IL-12、NO并未受到影响，以上结果说明丁酸的处理能够抑制成熟BMDCs细胞分泌细胞因子IL-6、IL-12、NO,而对不成熟BMDCs细胞并无影响。
2.3丁酸对BMDCs激活抗原特异性CD8+T细胞增殖能力的影响BMDCs细胞主要的功能之一是激活抗原特异性T细胞的活化与增殖。为进一步研究丁酸对BMDCs细胞功能的影响，我们将OVA抗原特异性OT1CD8+T细胞进行CFSE标记后，与OVA荷载的BMDCs进行共培养，然后分析7-AAD-CD8+T细胞的CFSE荧光强度来反映CD8+T细胞增殖情况。图3和表3中的结果显示，体外培养的不成熟BMDCs细胞与LPS刺激成熟BMDCs细胞均可引起OVA抗原特异性CD8+T的增殖，但成熟BMDCs显示出较不成熟BMDCs细胞更强的激活CD8+T细胞增殖的能力，该组的CD8+T细胞增殖分裂甚至可达到第7代，其第6代的CFSE荧光信号强度也强于不成熟BMDCs细胞组。但加入丁酸处理后，成熟BMDCs激活的CD8+T细胞增殖、分裂出现明显抑制。BMDC/LPS/BU组的CFSE荧光强度较BMDC/LPS组出现明显右移。此结果说明丁酸的加入使OVA抗原特异性CD8+T细胞的增殖受到明显抑制。而不成熟BMDCs细胞组与丁酸/不成熟BMDCs细胞组的结果显示，两组间T细胞的增殖的CFSE荧光信号强度最强的都在第4代，表示主峰都在第4代;同时，两组的最高细胞分裂代数可达6代，提示丁酸对不成熟BMDCs细胞组无明显抑制功能。
2.4丁酸对BMDC细胞TLR4信号通路ERK分子磷酸化的影响利用Westernblot检测0、15、30、60min时不同组BMDCs细胞MAPK通路信号分子ERK磷酸化的表达，并结合灰度扫描分析的结果显示：与不成熟BMDCs组相比，受LPS刺激成熟的BMDCs细胞胞内ERK分子的磷酸化在15、30、60min时间点上均发生上调;而丁酸处理后，其三个时间点的磷酸化ERK的表达均有下降，且以60min时下降最为明显，说明丁酸的处理对LPS激活的成熟BMDCs细胞MAPK信号通路ERK分子磷酸化有抑制作用。
3讨论
众所周知，人体肠道微生物菌群及其代谢产物在维持机体的免疫稳态中起着重要作用。作为肠道微生物的代谢产物之一，丁酸在肠道内呈现出较高的丰度，有文献报道，其小肠中的浓度达到0.1mmol/L到16mmol/L,而结肠中的浓度甚至可达到40mmol/L[9].如此高浓度的丁酸提示着该分子可能是肠道菌群调控机体免疫功能的重要分子之一。
有报道认为，丁酸可促进胸腺外调节性T细胞(Tregs)的分化与产生。该短链脂肪酸可依赖于固有Foxp3的增强子即保守非编码序列1(CNS1)促进胸腺外，而非胸腺内调节性T细胞(Tregs)的分化，并且可与T细胞相互作用增强Foxp3蛋白的乙酰化。也有研究认为，作为组蛋白去乙酰化抑制剂的丁酸在与DCs的相互作用中能降低促炎细胞因子的表达，从而加强Tregs的诱导[10].丁酸也可通过对组蛋白去乙酰化的抑制下调脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞分泌的促炎性介质，调节巨噬细胞的功能[11].本研究结果显示，丁酸能够在体外抑制成熟BMDC细胞共刺激分子的表达，下调其IL-12等细胞因子的表达，并抑制BMDCs细胞的抗原提呈功能。
树突状细胞(DCs)是机体特异性免疫应答的始动者，能诱导初始T细胞活化，同时也是体内重要的免疫调节细胞，可通过分泌不同的细胞因子参与固有和适应性免疫应答。来自微生物的病原相关分子模式(Pathogenassociatedmolecularpattern,PAMPs)分子，如LPS等，能使未成熟的DCs细胞获得成熟的表型，上调MHC分子和共刺激分子的表达，使DCs细胞获得诱导初始T细胞活化的能力[12].在正常的机体内，肠道内有着大量正常菌群的定居，其固有的PAMPs分子有着潜在的活化体内DC细胞功能的强大效应。这对于机体的免疫系统是十分危险的，因此，需要有一定的负相调节机制对其进行制约，以维持机体内的免疫稳态。而对肠道区域内DC细胞群体及功能的分析也发现，该区域内定居的DC细胞对外来的抗原刺激呈现低反应[13,14].考虑到丁酸在肠道内的高丰度存在，并结合其对其他免疫细胞已有的调节作用[10,11],我们推测其对DC细胞有负相调控效应，以降低DC的反应性，参与机体的免疫稳态。确实，丁酸对于LPS刺激成熟的BMDC细胞的表型及功能有着明显的抑制效应，显示了其对DC细胞的免疫负向调节功能，及其在维持免疫稳态中的潜在重要作用。但有意思的是，该短链脂肪酸分子对于未成熟的BMDC细胞的调控作用不明显，提示其可能通过干扰LPS介导的模式识别分子信号通路来下调DC细胞的功能。
已有的研究认为，LPS通过TLR4活化DC细胞至少通过两条分子信号通路[15].其中之一是NF-κB激活途径，即LPS与一系列相关分子作用激活有丝分裂原结合蛋白激酶(MAPK)途径，MAPK被活化后可磷酸化ERK、JNK、P38等多种底物，调节相关基因的转录[16].因此本实验选取MAPK途径中的ERK分子做检测，结果表明丁酸处理之后LPS刺激在BMDCs细胞中诱导的ERK分子的磷酸化确实受到抑制，提示其可能通过干扰MAPK通路，从而抑制LPS引起的树突状细胞的成熟与功能。但鉴于TLR4信号分子通路的复杂性，在此效应中是否还有MAPK途径中的其他信号分子或其他通路分子参与;同时，丁酸对其他PAMPs分子介导的信号通路是否也有类似的效应，如TLR2通路，还需要进一步研究。
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