肠道微生物组的现代分子生物学研究方法综述
传统微生物培养的研究方法和现代分子生物学技术是目前主要的两大研究手段，以下是小编搜集的一篇关于肠道微生物组的现代分子生物学研究方法探究的论文范文，欢迎阅读查看。
引言
微生物遍布于人体所有与外环境相通的器官。成人胃肠道黏膜表面积达300m2,是与外界环境接触并相互作用的最大区域，在其中定殖着约1×1014个微生物，数量是人体体细胞总数的10倍。肠道微生物参与宿主的能量吸收和储存，帮助宿主降解并吸收食物中的营养成分，还能促进免疫细胞分化与成熟、激活肠道免疫系统[1-3],具有非常重要的生理意义。但是由于人体肠道复杂的厌氧环境，40%~80%的肠道微生物难以在体外培养，仅凭培养手段进行微生物组研究会大大削弱肠道微生物的多样性。随着分子生物学技术的飞速发展，利用分子生物技术研究肠道微生物组的技术取得了极大的进展。掌握并运用这些新技术对肠道微生物组的研究十分关键，该文主要对肠道微生物组的现代分子生物学研究方法进行总结和介绍。
1传统纯培养检测方法
传统微生物检测方法是用各种培养基培养分离微生物，并通过革兰染色、生物化学和血清学试验等方法来确定微生物种类，通过倍比稀释、菌落计数等方法来测定微生物数量。但由于传统微生物培养技术中，菌株的富集或衰减不可避免，原始的微生态结构被改变，这会导致研究结果存在较大偏差。
Moore等[4]利用传统培养方法对20例男性的粪便样品中微生物种类和相对数量进行了研究，研究对象包括日本到夏威夷的60~80岁的健康个体，食谱包括东西方饮食，将取到的粪便样品进行培养分析，得到1147个纯培养物，鉴定为113种不同的微生物。然而据报道，人体肠道至少存在400种微生物[4],因此这种培养方法会漏掉多数的、营养条件要求更为苛刻的微生物。
2传统分子生物技术
2.1肠道菌群DNA提取技术
从粪便样品中提取高质量的、具有代表性的肠道菌群总DNA是肠道微生物分子生物技术研究的基础。目前提取肠道菌群总DNA的方法主要有酚/氯仿抽提法、Chelex-100煮沸法、GuSCN/silica法以及一些商业试剂盒，如FastDNAkit、QuantumPrepAquapureGenomicDNAisolationkit、QIAampDNAStoolMinikit等。其中QIAampDNAStoolMinikit的提取效果得到较多肯定。试剂盒应用方便、快捷，但价格昂贵，处理大批样品时科研成本太高。相较而言，酚/氯仿抽提法快速且成本低，适合用于肠道微生物研究中总DNA提取，尤其适合处理大批量样品。
2.2构建基因文库测序技术
2.2.1构建16SrRNA基因文库
16SrRNA基因克隆文库通过扩增各种细菌共有基因序列片段对细菌进行定性定量分析，是一种有力的细菌学检测分析手段，现已广泛用于肠道和人体其他部位微生物多样性研究[5-7],并通过该方法发现了许多尚未培养到的菌种。16SrRNA基因克隆文库技术可以分析标本中的菌群结构，反映各种细菌的相对比例及数量，具有培养法难以比拟的优势，不足之处是实际操作中技术环节多、影响因素复杂、不同实验室操作条件难以标化以及对标本中的细菌数量有一定要求等。但相信随着技术的不断提高，16SrRNA基因序列分析将逐步成为微生物组结构研究的有力工具。
2.2.2全基因组鸟枪测序分析技术
Gill等[8]利用全基因组鸟枪(Shot-gun)测序技术分析了两名健康成年人粪便中的菌群，首次对人体肠道微生物多样性进行了全面的描述。
Qin等[9]运用深度Shot-gun测序法研究发现，Ⅱ型糖尿病患者的肠道菌群中度失调，产丁酸盐细菌丰度降低，而致病微生物的功能增加。相较于传统的基于rRNA的研究，Shot-gun测序分析技术可以找到更多的进化标记，得到更多的菌群信息，且Shot-gun技术不需PCR扩增，因此分析出的结果偏差较小;此外，通过序列数据分析，还可以对微生物基因表达及功能状态情况进行研究。其缺点在于微生物系统组成复杂，将大量的序列信息正确地装配成每个成员的基因组全序列，是一个较大的难题。
2.3遗传指纹图谱技术
构建基因文库的方法可以得到样本中的菌群种类和相对进化信息，然而，我们常需要对整个肠道微生物组进行动态监测，构建基因文库方法会显得费时、费力，不能做出快速检测，这时遗传指纹图谱技术可克服上述不足，快速灵敏地检测生态系统的动态变化。
2.3.1变性梯度凝胶电泳及其衍生技术
变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophore-sis,DGGE)技术是由Fisher等发明的，Muyzer等首次将其应用于微生物群落结构研究，随后Zoeten-dal将其用于人体肠道菌群的分析研究。后来在其基础上衍生出温度梯度凝胶电泳(temperaturegra-dientgelelectrophesis,TGGE)、瞬时温度梯度电泳(temporaltemperaturegradientgelelectrophesis,TTGE)、脉冲场凝胶电泳(pulsedfieldgelelectro-phoresis,PFGE)和单链构象多态性检测(single-strandedconformationalpolymorphisms,SSCP)等。此后，该技术被广泛应用于消化道排泄物中微生物的分析[10-11].
DGGE及其衍生技术既可以对比分析不同的微生物群落之间的差异，鉴别细菌种类，也可以研究同一个微生物群落随时间和环境改变的动态变化过程。但该技术用通用引物进行PCR扩增时，可能会忽视一些数量较少的细菌，并且肠道微生物组种类繁多，最终获得的电泳条带复杂且拥挤，增加了结果分析的困难。
2.3.2随机扩增多态性
DNA技术随机扩增多态性DNA(randomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术利用寡核苷酸序列在基因组上随机配对的特性，经扩增得到一系列大小不同的产物，通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳便可得到一系列基于RAPD的指纹图谱。因为不同模扳DNA产生的指纹图谱有差异，因此可用于鉴定微生物种类，并且灵敏度高，常被用于细分微生物组内的种群差异[11-12].
RAPD技术的缺点在于重复性和稳定性差，产生的图谱条带过于复杂，需要进行大量的筛选，从中找到较为合适的引物进行分析，较为费时。
2.3.3末端限制性片断长度多态性分析技术
末端限制性片断长度多态性分析(terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphisms,T-RFLP)技术通过自动测序仪分析酶切后的末端序列，达到定量的目的，因为末端序列来自16SrDNA,因此可用于复杂的肠道微生物群落结构的研究，快速灵敏地评估群落中微生物的多样性，并给出微生物群落结构的指纹图谱，是目前被广泛采用的一种指纹图谱技术，现已成功应用于各种微生物群落结构和多态性的比较分析[13-14].
其缺点在于该技术只检测末端序列，因此不可避免地会低估微生物群落结构多态性。同时它是基于PCR扩增技术，实验过程影响因素较多，亦会对结果造成影响。
2.4荧光原位杂交技术
除了上述技术外，分子杂交技术也被广泛应用于肠道微生物组的研究中，同样表现出应用潜力和优点。
Giovannoni等首次应用荧光原位杂交(fluo-rescenceinsituhybridization,FISH)技术进行细菌学的研究。随后Delong等使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。经过不断的丰富和完善，FISH技术已成为近年肠道微生物研究中一种重要的检测工具[15-16].其利用荧光素标记16SrRNA基因序列的寡聚核苷酸探针，与靶细菌杂交，通过检测目标序列来鉴定微生物，具有敏感、快速、安全等优点。
FISH技术还可用于鉴定和检测未培养种属和新种属。其缺点在于FISH技术尚不能用于16SrRNA序列未知微生物的检测，且在操作时易受到污染干扰，同时结果会受到微生物营养状态的影响。
由于肠道微生物组种类繁多，而联合流式细胞学技术可进行高通量分析，已越来越多地应用于FISH信号检测。
3新近发展的方法技术
3.1基因芯片技术
基因芯片技术(DNAchips)原理是使探针分子在滤膜、硅片、玻璃等介质上排列成微矩阵，将待检样品标记后与微矩阵杂交，通过检测样品杂交信号强度即可获得样品中基因序列及数量等信息，具有快速、高效、低成本等优点，现已广泛应用于微生物群落结构及功能的研究[17-19],并且其敏感性和特异性已经得到了反复验证[20-21].
目前尚没有应用基因芯片进行人体肠道微生物研究的报道，但基因芯片包括大量针对人体肠道微生物的功能基因，并且其子类型HummChip是专门针对人体微生物设计的，因此基因芯片技术应用于肠道微生物研究不存在技术问题。
3.2宏基因组学技术
宏基因组学即将环境中全体微生物的遗传物质看作一个整体，系统全面地研究微生物与其生存环境之间的关系。通过宏基因组测序技术可发现肠道菌群结构改变，结合其代谢特征可分析肠道微生物与代谢性疾病之间的联系。宏基因组学还可用来发现新发传染病病原以及未知病原。美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth,NIH)的人类微生物组计划[22-23]利用宏基因组学技术分析了242个美国健康志愿者微生物基因组，获得了近800个菌种的基因参考序列。
宏基因组学技术为肠道微生物组的研究提供了新的思路与方法，为充分认识和利用未培养微生物、完整地从群落水平上认识微生物开辟了新的道路。
3.3第二代测序技术
2005年底Roche公司建立454测序技术，该技术结合DNA扩增乳胶和皮升级反应孔进行焦磷酸盐测序，可对微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系进行研究，具有速度快、通量高、读长长、准确性高、一致性好及简便高效的优势。
Gosalbes等[24]运用454测序技术对10位健康人的肠道微生物群落结构和组成进行了研究，发现发现厚壁菌门占49.18%,拟杆菌门占31.42%,变形菌门占3.6%,放线菌门占0.4%.454测序技术在肠道微生态研究中已经得到较为广泛的运用[25],然而454测序同样存在着缺点，主要在于片段长度短，对连续单碱基重复区域测序准确性差，常会产生缺失或者插入误差。但随着454测序分析技术的`发展成熟，终将得到更准确、可靠的结果。
相较于454测序技术，Illumina测序表现出低错误率、低成本和高通量等优势[26-27].但是，Illumi-na测序长度短，所获得的序列数量巨大，呈数十倍增长，原有生物信息学分析工具无法计算，因此解决其运算问题是Illumina用于微生物群落分析的关键之处。随着Illumina测序读取长度的改善及新型分析工具的开发，预计Illumina测序技术将因其高性价比的优势广泛应用于肠道微生物组的研究。
4展望
从1975年Woese等首次应用rRNA分析菌群以来，rRNA数据库迅速扩大，16SrRNA基因作为细菌的标志，已逐渐成为临床细菌分类、鉴定的金标准。传统分子生物学技术多以16SrRNA基因为基础，Shot-gun测序费用高昂且分析过程繁琐复杂，目前难以大规模推广使用，DGGE技术相对简单高效，T-RFLP较为方便快捷。基因芯片用于个体间肠道菌群对比时灵敏性较好，且具有高通量特点，预计可广泛应用于临床检验。宏基因组测序可保留样本中全部菌群的信息，在肠道菌群多样性研究中正逐渐盛行。焦磷酸测序能自动化检测大量的样本，近年来发展迅速。然而分子生物学技术均为多学科技术融合渗透的成果，必然在某些方面存在不足和一些亟待解决的关键问题，且这些方法都受制于样本中获得的DNA质量及其PCR效果。但随着科学技术的不断发展，相信这些问题会得到解决，相关技术一定会在肠道微生物的研究中发挥更加重要的作用。
总之，肠道微生物组研究主要包括微生物组的多样性和功能活性等两方面。传统微生物培养的研究方法和现代分子生物学技术是目前主要的两大研究手段，其中现代分子生物学技术具有快速、高效的特点，尤其是对于不能被培养的微生物的研究具有传统微生物培养方法无法替代的优势。而传统的微生物培养方法，可通过培养、分离、鉴定获得存活的纯微生物，进而在微生物整体水平上进行研究。因此，综合应用各种肠道微生物组的研究方法和技术才能进一步加快对肠道微生物组多样性及其功能的研究和认识。
参考文献
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[3]ROUNDJL,LEESM,LIJ,etal.TheToll-likereceptor2pathwayestablishescolonizationbyacommensalofthehu-manmicrobiota[J].Science,2011,332(6032)：974-977.
[4]MOOREWEC,HOLDEMANLV.Humanfecalflora:thenormalfloraof20Japanese-Hawaiians[J].ApplMicrobiol,1974,27(5)：961-979.
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