结核病血清诊断中HSP65的应用前景分析
[摘要] 目的通过评价HSP65抗原表达在结核病血清诊断中的'效果，分析其应用前景。方法取活动期结核病患者63例纳入观察组，选取体检健康志愿者60例纳入对照组，就HSP65分别与38 kDa、16 kDa、LAM联合检测诊断对照组与观察组结核病。结果W estern-hlot结果显示，表达产物在相对分子量65 kμ处有一条表达带，在健康人血清阴性中则无表达带;特异度、敏感度与38 kPa基本一致，差异无统计学意义(P>0.05)。结论HSP65在结核病血清诊断中可作为备选标志物，反应强度与38kDa基本相当，联合诊断有助于提高诊断符合率;HSP65对结核病X线空洞影敏感度较高。
[关键词] 结核病;血清学;HSP65;结核分歧杆菌
结核病(tuherculosis，TB)是一种结核分枝杆菌感染引起的传染病，全世界每年约有20亿人感染结核分枝杆菌(M.tuherculosis，MTB)，我国TB发生率、发病率、病死例均位于世界前列，TB防控形势仍不容乐观。MTB潜伏性是致TB防控效果不佳的主要原因之一，感染者早期常无典型症状表现，且难以根除，无症状携带者对MTB抗原产生迟发型超敏反应(DTH)是潜伏期诊断的唯一指标。
一、资料与方法
1.1 一般资料
以2013年2月-2014年5月该医院收治的所有活动期结核患者作为研究对象。纳入标准：①临床确诊，活动期患者;②知情同意;③临床资料完整。入选患者63例纳入观察组，其中男33例、女30例，年龄27～ 64岁，平均(44±14)岁，病程1～8年，平均(1.5±3.2)年，抗酸染色阳性43例、痰细菌培养阳性52例、PPD皮试阳性35例，X线片结核空洞影46例。选取体检健康志愿者60例纳入对照组，其中男31例、女29例，年龄28～64岁，平均( 45±12)岁，未合并有肺部疾病，如肺结核、肺炎，两组患者年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)。
1.2 材料与试剂
E.coli DH5α、MTB H37Rv株，pPRO EX Hrra原核表达载体，GCG疫苗株，Takara公司提供。LA Taq DNA聚合酶、Ecor I试剂Takara公司提供，T4连接酶、质粒DNA小量提取试剂盒(上海生工生物工程有限公司产)，DNA快速纯化/回收试剂盒，标准蛋白分子量、HRP-羊抗鼠IgH、HRP-羊抗人IgG，鼠抗MTB HSP65 mAh等。仪器主要包括：TGL.16G高速台式离心机，HERAEYS C02培养箱，法VILBER LOURMAT公司产VILBER凝胶成像仪，SPECORD 40紫外分光光度仪，-70℃超低温冰箱，倒置显微镜，生物安全台，医用净化工作台，Dy-3D型多功能电泳仪，紧密电子天平，Olymhus公司荧光显微镜，SUN公司酶联免疫吸附仪等。
1.3 方法
制备E.coli DH 5α感受态细胞。参照GenBank组织标准MTB HSP65编码，设计引物，由北京奥科生物技术有限公司提供。扩增HSP65基因，扩增产物行DNA快速纯化回收。回收产物与克隆载体，将混合物以热休克法转化为E.coli DH5α感受态细胞，观察白色菌落。进行重组质离酶切鉴定、序列测定，阳性克隆名为pPRO-hsp65，进行鉴定，取鉴定正确的阳性菌行IPTG诱导，诱导后行SDS-PAGE凝胶电泳分析。以Ni-NTA纯化试剂盒纯化蛋白，离心100 mL诱导菌液，制备样品，进行亲和色谱纯化，收集洗脱液，以紫外分光光度仪测定纯化蛋白浓度，将洗脱液以置于-20℃恒温冰箱保存备用。
表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳分析后，100 V恒压电转1 h行蛋白电转，后转至硝酸纤维素膜上、行丽春红染色，若蛋白电转成功，以蒸馏水洗至褪色，以10 g/L牛血清白蛋白TBST封闭30 min，连续震荡洗涤3×5 min，分别以鼠抗MTB HSP65 mAh、观察组患者血清、对照组健康人血清结合1 h，TBST震荡洗涤3×5 min，加HRP标记羊抗鼠IgG结合th，TBST震荡洗涤3×5 min，以OPD显色液观察结果。同时，联合目前临床已相对成熟的38 kDa、16 kDa、LAM抗原血清学应答辅助诊断，将观察组与对照组患者血清编号打乱，观察组作为“真阳性”、对照组为“假阳性”，则敏感度=观察组中检查出的阳性例数/真阳性例，特异度=观察组中检查出阴性例数/真阴性例。
1.4 统计方法
数据以SPSS 13.0软件处理，计数资料以[n(%)]表示，组间比较采用X?检验。
二、结果
2.1 不同抗原表达血清诊断
Western-hlot结果显示，表达产物在相对分子量65 kμ，处有一条表达带。HSP65分别与38 kDa、16 kDa、LAM联合检测，敏感度、特异度均有不同程度提高，其中与38 kDa联合检测敏感度、特异度最高，HSP65+38 kDa敏感度高于HSP65，HSP65特异度高于16 kDa，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1
抗酸染色、PPD皮试与X线片对HSP65检测影响
HSP65血清抗原检测正确者X线片结核空洞影比重高于错误者，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
三、讨论
该次实验以Ppro EX HTa表达为载体，行酶切位，高效转录Trc启动子，以表达HSP65基因，有利于蛋白的分离纯化，且表达较稳定，蛋白生物学活性保留较好。分离纯化HSP65，行血清学检测结果，显示敏感度达68.75%、特异度达86.67%，高于LAM、16 kDa，与38 kDa基本持平，后三者均为目前临床常用的MTB感染血清学诊断标志物，提示HSP65可作为血清学诊断TB单独标志物。此外，HSP65+38 kDa敏感度高于HSP65，HSP65特异度高于16 kDa，差异有统计学意义(P<0.05)，提示联合检测可能提高检测敏感度，但无法有效提高特异度。关于LAM、16 kDa、38 kDa血清学诊断肺结核研究较少，敏感度在40%～90%之间，如林楠等以4种结核抗原进行结核病血清学诊断，单独应用灵敏度在30.9%～66%，特异度76.2%～90.5%，不同学者研究结果存在较大差异，这与不同患者肺结核严重程度、结核分枝杆菌活动度存在较大差异纳入患者标准不统一有关，血清学检测运用于结核病诊断敏感度仍较低，大规模推广尚需时日。
该次研究表明，HSP65诊断正确者抗酸染色阳性比重、PPD皮试阳性比重差异无统计学意义(P>0.05)，提示抗酸染色阳性比重、PPD皮试阳性不能真实反映MrrB应激状态。HSP65血清抗原检测正确者X线片结核空洞影比重高于错误者，差异有统计学意义(P<0.05)，提示X线片空洞形成与MTB应激有关，提示患者病情已进入或将要进入活动期。刘志辉等对结核性胸膜炎患者结核分枝杆菌培养滤液、胸腔积液和血清蛋白质组进行分析，结果显示滤液、胸液与血清特异性蛋白质标志物密切相关，而滤液、胸腔积液与空洞形成有关。目前，已有血清学快速诊断肺结核技术，孟炜而等以血清腺苷脱氨酶诊断肺结核敏感度达94.0%、特异性70.7%，具有较高的应用价值，HSP65在结核病血清诊断中的应用仍有待时日。
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