药物对肾小球抑制作用的对比分析
论文关键词：肾小球 物 作用 对比
论文摘要：采用体外培养的人肾小球系膜细胞技术，观察具有降逆泄浊、益气活血功效的肾康注射液及苯那普利对ECM不同成分的影响。肾康注射液具有抑制ECM成分中纤维连接蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)和Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)的作用，该抑制作用具有一定的量效关系。苯那普利对ECM中FN、Col Ⅳ也有一定的抑制作用，但不及肾康注射液作用明显。结论，肾康注射液对ECM的抑制作用优于苯那普利。
近年来，随着对肾小球硬化机制认识的不断深入，肾小球系膜细胞(MC)、细胞外基质(ECM)及各种细胞因子在肾功能进行性减退过程中所起的作用倍受关注。抑制MC增殖，减少ECM的堆积，拮抗细胞因子的不良作用，已成为防治肾小球硬化，延缓CRF病情进展的重要环节。
一、对比研究使用的
选用的材料
1、肾组织来源系我校附属医院妇产科孕5月引产胎肾。
2、药物与试剂肾康注射液(SKI)由大黄、丹参、红花等组成，成都药大学附属医院提供，每毫升含原生药0.3g；苯那普利(Benayzepril)由瑞士诺华制药有限公司生产，批号：012200；V型胶原酶、HEPES均系Sigma产品；RPMI 1640、胰蛋白酶、胰岛素均为美国GIBCO产品；小鼠抗人单克隆FN抗体、兔抗人FN多抗、羊抗兔IgG-HRP均购于北京中山生物技术有限公司；LN、Col Ⅳ放射免疫分析试剂盒，均购于上海海研生物技术中心。
3、主要仪器CO2孵箱(TYPE4型)德国HERAEUS公司生产；倒置显微镜(TOKYO)日本OLYMPUS公司生产；洁净工作台(月坛牌)北京半导体设备一厂生产；酶标分析仪(MODEL2550)美国BTO-RAD公司生产；FT-613自动计数125 I放免测量仪，北京核仪器厂生产。
二、研究采用的方法
1、MC培养与鉴定无菌取胎肾，分离提取肾皮质小球组织，按照于力方等方法(1)取去掉包囊的单个肾小球进行原代和继代培养，实验中使用传代5代的MC。培养的细胞经免疫病理鉴定证实为单纯的MC，无上皮细胞、肾小管细胞及成纤维细胞污染。
2、分组及MC上清的收集吸取培养的第5代MC培养瓶中液体，加胰酶1ml，置孵箱(5%CO2、37℃)中消化3min，加10% FCS 1640终止液2ml，抽吸于离心管中，800rpm，离心3min，弃上清，加15% FCS 1640培养液于离心管中，吹打，混匀。用计数板计数后，倾入加样槽中，用8导加样枪，按每孔200μl，密度4000/孔铺板。将96孔板按列从左至右依次分为空白对照组(简称组Ⅰ)、苯那普利组(简称组Ⅱ)、肾康注射液高浓度组1、2(简称组Ⅲ、组Ⅳ)、肾康注射液中浓度组1、2(简称组Ⅴ、组Ⅵ)、肾康注射液低浓度组1、2(简称组Ⅶ、组Ⅷ)，共8组(列)，每列6孔，待细胞贴壁24h后，每孔加无血清1640培养液200μl同步24h。除空白对照组外，其余各组分别依次加入苯那普利10－3mmol/L及肾康注射液100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/ml，待刺激48h后依次收集上清待测。
3、测定ECM中FN的含量用双抗体夹心ELISA法，0.5mg/ml鼠 抗人FN抗体原液用包被缓冲液稀释1000倍。取96孔板，50μl/孔铺板，4℃过夜，甩去。用PBS－吐温20洗涤液洗板3次，每次3min，间隔2min，控干。每孔加1%BSA封闭液100μl，37℃，1h后甩去，控干。依次按组各孔分别加入待测上清50μl，37℃，3h后甩去，洗板4次后，加兔抗人FN抗血清(原液用0.1% BSA·PBS1∶1000稀释)50μl/孔，室温放置60min。加HRP羊抗兔IgG(用0.1% BSA·PBS1∶1000稀释)50μl/孔，室温放置50min。再洗板4次后，每孔加入OPD显色液50μl，预热酶标仪，用2M H2SO4终止液50μl/孔终止，立即在492nm波长读数，并记录OD值。