毛细管电泳吡啶钌电化学发光检测天仙子中生物碱

毛细管电泳吡啶钌电化学发光检测天仙子中生物碱

摘要 建立了毛细管电泳吡啶钌电化学发光技术测定中药天仙子中二种生物碱的方法。考察了进样条件、分离条件以及检测条件对样品分析的影响。在优化的条件下: 检测电位1.2 V; 分离缓冲溶液pH 8.48; 检测池缓冲溶液pH 7.48 ; 进样高压12 kV; 进样时间9 s, 阿托品在0.29 mg/L -5.8 mg/L、东莨菪碱在3.0 mg/L-303 mg/L范围内呈良好线性关系(相关系数 0.997以上)。 阿托品和东莨菪碱检测限分别为：0.014 mg/L、0.03 mg/L。本方法具有样品用量少、灵敏度高、线性关系好、选择性好等优点，能有效避免中药样品提取物中干扰物质的影响, 已成功地用于中药天仙子中生物碱的检测。
关键词 毛细管电泳 电化学发光 检测 天仙子
1 引言
天仙子是一种传统的天然中草药，为茄科植物茛菪干燥成熟种子。具有行气活血, 利水消肿的功能。用于脘腹刺痛, 关节痹痛, 妊娠水肿等病症的治疗。近年来, 还发现天仙子对癌症治疗有独特的疗效。天仙子两种主要活性成分为阿托品和东莨菪碱，文献报道这两种活性成分的分析方法有：核磁共振技术[1]、紫外分光光度法[2]、高效液相色谱法[3-6]和毛细管电泳分离等技术[7，8 .9]。尽管毛细管电泳（CE）技术具有进样体积小, 操作费用低廉, 可以提供高分离效率等优势。但由于CE 进样量微小, 因此CE 方法所面临的主要挑战是寻找与之相匹配的检测方法，以提高待分析物的检测灵敏度。电化学发光（ECL）是通过电化学方法产生某些特殊物质，然后这些电生物质之间或电生物质与其它物质之间进一步反应而产生发光，从而把电能转化
为光辐射能的一种分析手段[10]。研究表明电化学发光是一种灵敏度高、选择性好的检测方法[11.12]。在众多的电化学发光体系中, Ru(bpy)32+电化学发光具有试剂稳定性高、水溶性好、引发电势值适当、激发态寿命长、发光效率高、反应无须除氧以及Ru(bpy)32+可循环再生等优点[13.14]， Ru(bpy)32+电化学发光已成为研究最多的分析体系。作为一种高度灵敏的检测技术，Ru(bpy)32+电化学发光被成功地应用于样品痕量分析，有关它的应用被广为综述[15-17]。CE 与三联吡啶钌电化学发光技术联用（CE-ECL）将二者的优势有机组合，已成为分析化学领域中强有力的分析工具[18]。
本文采用CE-ECL分析技术，检测中草药天仙子中的二种生物碱,具有灵敏度高、样品用量少、选择性高等特点。

2 实验部分
2.1 仪器与试剂
毛细管电泳电化学发光综合分析仪（西安瑞迈电子科技有限公司，中国）。ECL 检测采用三电极系统：直径500 μm Pt 盘工作电极、Ag/AgCl 饱和参比电极、Pt 丝对极。未涂层石英毛细管52 cm×25 μm i d（河北永年光学纤维厂，中国）。Ru(bpy)32+六水合氯化物(Aldrich，DOI: 10.3724/SP.J.1096.2010.009152010, 38(6):915美国）。硫酸阿托品和氢溴酸东莨菪碱（Sigma，美国）。磷酸盐、氢氧化钠、氯仿和石油醚
均为分析纯。二次蒸馏水采用Mili-Q 超高纯净水体系（Milipore, 美国）制备，所有溶液均用二次蒸馏水配制。中药天仙子购于长春市药材公司。
2.2 实验方法
毛细管用0.1 mol/L氢氧化钠充满浸泡过夜。电泳分离之前，分别用0.1 mol/L氢氧化钠、二次蒸馏水、缓冲液冲洗毛细管各10 min。ECL检测池构造如先前文献报道[19]，池中添加5mmol/L Ru(bpy)32+、50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.48），池中溶液3 h后更换一次,以保持实验重现性。本实验采用柱端ECL检测模式，借助光学显微镜准直工作电极与毛细管出口端，并固定二者距离为150 μm。电动进样12 kV×9 s，分离缓冲溶液pH 8. 48，检测电位1.2 V，光电倍增管偏置电压800 V。
2.3 天仙子中生物碱的提取
取约0.5 g 碾成粉末状的天仙子准确称重，加入5 ml 石油醚超声20 min，弃掉石油醚层。加入4 mL 氯仿超声20 min，萃取过程重复两次。提取液合并后挥干，残余物用二次水溶解，经0.45 μm 醋酸纤维膜过滤，滤液储存于4 °C 冰箱中备用。
3 结果与讨论
3.1 分离检测条件的优化
3.1.1 检测电位的影响
ECL 检测方法的显著优势在于其电化学发光反应的可控性，合适的检测电位是生物碱与吡啶钌ECL 共反应的基础。利用CE-ECL 体系，在1.1 V ~ 1.3 V 范围内考察检测电位对阿托品和东莨菪碱ECL 反应的影响。由图1 可见随着激发电位的升高，两种成分的ECL 强度逐渐增强。1.2 V 时ECL 强度达到最高值。继续增高检测电位，ECL 强度反而呈下降趋势。(1)、(2) 分别是阿托品和东莨菪碱的ECL 强度随检测电位变化的曲线。
 
图1 检测电压对ECL 强度的影响Fig. 1 Effect of detection potential on the ECL intensity曲线a: 10-5 mol/L 阿托品的ECL 强度（atropine）；曲线b: 10-4 mol/L 东莨菪碱的ECL 强度(scopolamine)。检测池底液：5 mmol/L Ru(bpy)32+ + 50 mmol/L 磷酸盐（phosphate）；电动进样（electrokinetic injection）7 s×10 kV；分离电压（separation voltage）15 kV。
3.1.2 分离缓冲溶液pH 值的影响
分离缓冲溶液的pH值不仅影响着待分析物所带电荷量还影响着毛细管内的电渗流。本实验通过改变缓冲溶液pH值来考察对两种样品分离的影响，当缓冲溶液pH值在4.06到6.08之间，阿托品和东莨菪碱ECL两峰重叠。尽管阿托品和东莨菪碱的pKa值相差无几[20.21]，但随着缓冲溶液pH值的增加，部分质子化的东莨菪碱迁移行为发生显著改变，两种生物碱的迁移时间间距加大，样品开始部分分离，当缓冲溶液为pH 8.48时分离度最高。但是继续增
大碱度它们的分离度反而减小（见图2），可能是由于二者在偏碱性缓冲溶液中荷质比类似具有相近的迁移行为所致。阿托品和东莨菪碱的分离度按下式计算：Rs=2(t2-t1)/(Wb1+Wb2)，式中：t1、t2分别为代表两种生物碱的迁移时间，Wb1、Wb2则代表测得两种生物碱的基线峰宽。
 

图2 缓冲溶液pH 对分离度的影响Fig. 2 Effect of buffer pH value on resolution样品（sample）：10-5 mol/L 阿托品和10-4 mol/L 东莨菪碱； 检测电压(detection voltage)1.2 V；电动进样(electrokinetic injection) 7 s×10 kV；分离缓冲溶液(separation buffer): 20 mmol/L 磷酸盐；分离电压(separation
 
voltage) 15 kV。
3.1.3 检测池缓冲溶液pH 值的影响
在吡啶钌与生物碱ECL 共反应中，生物碱首先脱去质子，进而氧化形成还原态自由基中间体。该自由基中间体继续脱去质子，与三价吡啶钌发生共反应从而放出光子。由此可见溶液的pH 环境对于ECL 共反应有重要的影响。
缓冲溶液pH 值对两种生物碱ECL 的影响见图3。随着pH 值的增大，阿托品和东莨菪碱的发光强度增高呈现出先增长后下降趋势，在pH 7.48 和pH 6.03 处，阿托品和东莨菪碱分别取得最高ECL 强度。但是随着pH 增大阿托品和东莨菪碱分离度逐渐增大。考虑缓冲溶液pH 值对两种生物碱分离和检测的综合影响，本实验将池中缓冲溶液pH 定为7.48。
 

图3 池中缓冲溶液pH 对ECL 强度和分离度的影响Fig. 3 Effect of buffer pH value on resolution and ECLa: 阿托品ECL 强度；b：东莨菪碱ECL 强度；c：分离度（resolution）sample: 10-5 mol/L 阿托品和10-4 mol/L 东莨菪碱； 检测电压(detection voltage) 1.2 V； 电动进样（electrokinetic injection）7 s×10 kV；分离缓冲溶液(separation buffer) 20 mmol/L；分离电压15 kV。
3.1.4 进样电压和进样时间的影响
电动进样模式中进样量受进样时间和进样电压双重因素的影响。通常进样时间越长，进样电压越高，就会有更多的样品导入毛细管，到达电极表面，产生高的ECL 强度。但如果样品过载也会引起样品区带展宽，分离效率降低，分离度下降。如果缩短进样时间或者降低进样电压，虽然可以得到较高的柱效，但却很难获得满意的ECL 强度。职称论文
首先固定进样时间在7s，改变进样电压2 kV～16 kV，阿托品和东莨菪碱ECL 强度和分离度的变化趋势如图4 所示。另一方面改变进样时间，随着进样时间的增加，两种待测成分的ECL 强度和分离度也呈相同变化趋势，见图5。折衷考虑进样量对检测灵敏度和分离度双重影响，将电动进样条件12 kV×9 s 应用于后续试验中。
 
图4 进样电压对阿托品(a)和东莨菪碱(b)ECL 强度及分离度(c)的影响Fig. 4 Effect of injection voltage on resolution (c) and ECL intensity of atropine (a) and scopolamine (b)样品(sample)：10-5 mol/L 阿托品和10-4 mol/L 东莨菪碱； 检测电压（detection voltage）1.2 V；进样时间(injection time)7 s；分离缓冲溶液(separation buffer) 20 mmol/L；分离电压(separation voltage)15 kV。
 
图5 进样时间对阿托品(d)和东莨菪碱(e)ECL 强度及分离度(f)的影响Fig. 5 Effect of injection time on resolution (f) and ECL intensity of atropine (d) and scopolamine (e)样品（sample）：10-5 mol/L 阿托品和10-4 mol/L 东莨菪碱； 检测电压（detection voltage）1.2 V；进样电压
DOI: 10.3724/SP.J.1096.2010.00915
2010, 38(6):915
（injection voltage） 12 kV；分离缓冲溶液（separation buffer）20 mmol/L；分离电压(separation voltage)15 kV。
3.2 线性范围、精密度和检测限
在所选择的最优条件下, 阿托品和东莨菪碱分别在0.29 mg/L -5.8 mg/L、3.0 mg/L -303mg/L范围内,浓度与峰高呈良好线性关系。在优化的条件下分别以阿托品（10-5 mol/L）和东莨菪碱(10-4mol/L)标准溶液连续6次进样，测定ECL峰高以及样品迁移时间，二种生物碱峰高与迁移时间的RSD见表一。阿托品和东莨菪碱的检测限分为0.014 mg/L，0.03 mg/L（S/N=3）。与其它传统的分析方法相比较，该方法具有灵敏度高、选择性好，操作简便，
快速分析的优越性能。文献报道几个方法与现有方法的比较见表二。

  3.3 中药天仙子的测定
在最佳分析条件下，取中药天仙子提取液进行适当稀释，应用本方法测定天仙子中二种主要活性成分阿托品和东莨菪碱，典型电泳谱图见图6。与加标电泳谱图相比较，可以定性鉴别阿托品和东莨菪碱。采用标准加入法，获得天仙子中生物碱的含量为：阿托品0.035% 东莨菪碱0 . 051%。同时做加标回收实验，阿托品和东莨菪碱的样品回收率分别为：96.21%、97.04%。

 图6 中药天仙子稀释萃取液的电泳谱图Fig. 6 Electropherogram of the diluted extract(1) 阿托品的 ECL 强度；(3) 东莨菪碱的ECL 强度；(2) 提取液中未知成分的电泳峰电动进样（injection）12 kV×9 s；其它条件同图5。
4 结论
毛细管电泳吡啶 电化学发光联用技术用于中药天仙子中生物碱的分析。在优化的条件下，三联吡啶钌CE-ECL 分离检测体系体现了选择性好、灵敏度高、精密度好、分析时间短、线性关系好等优良性能。应用该方法可成功地测定中药天仙子中的二种生物碱，该技术可以作为定量分析中药天仙子活性成分的有力工具。
致谢
本文系中国科学院长春应用化学研究所电分析国家重点实验室、吉林省科技发展计划项目(No.20070555 )以及吉林省教育厅科研计划项目(吉教科合字[2006]第145号 )资助课题
References
1. Naqvi A A, Mandal S, Verma R K. Phytochemical analysis, 1998, 9: 68~170
2 Li huifen(李惠芬), Lu jixin(卢继新), Zhang xiaomei(张晓梅),Dong zhihua(董志华). Chinese Traditional and
Herbal Drugs (中草药), 1999, 30: 582~583
3.Wang huan(王环), Pan li(潘莉), Zhang xiaofeng(张晓峰). Northwest Pharmaceutical Journal (西北药学杂志),
2002, 17: 9~10
4. Ma cuiying(马翠英)，Chen dechang(陈德昌)，Yang zhaoqi(杨兆起). Chinese Journal of Pharmaceutical
Analysis (药物分析杂志), 1996, 16: 119~122

5. Li huifen(李惠芬), Zhang qingwei(张庆伟), Zhang xiaomei(张晓梅), Dong weilin(董伟林). Chinese
Traditional and Herbal Drugs(中草药), 1999, 30: 184~185
6. Mandal S, Naqvi A A，Thakur R S. Phytochemical Analysis, 1991, 2: 208~210
DOI: 10.3724/SP.J.1096.2010.00915
2010, 38(6):915
7 Eeva M, Salo J P, Oksman-Caldentey K M. J. Pharm. Biomed. Analy., 1998, 16: 717~722
8 Mateus L, Cherkaoui S, Christen P, Veuthey J L. Electrophoresis, 1999, 20: 3402~3409
9 Tong ping(童 萍), Zhong maosheng(钟茂生), Zhang lan(张 兰), Journal of Fuzhou university(福州大学学报),
2009, 37 :286~289
10 Velasco J G. Electroanalysis, 1991, 3: 261~271
11 Gerardi R G, Barnett N W, Lewis S W. Anal. Chim. Acta, 1999, 378: 1~41
12 Fahnrich K A, Pravda M, Guilbault G G. Talanta, 2001, 54: 531~539
13 Honda K, Yoshimura M, Rao T N, Fujishima A. J. Phys. Chem. B, 2003, 107:1653~1663
14 Knight A W. Trends in Anal.Chem. 1999, 18: 47~62
15 Fahnrich K A, Pravda M, Guilbault G G. Talanta, 2001, 54: 531~539
16 Knight A W. Trends in Anal.Chem., 1999, 18: 47~62
17 Richter M M. Chem. Rev., 2004, 104: 3003~3036
18 Yin X B, Wang E K. Anal. Chim. Acta., 2005, 533: 113~120
19 Cao W D, Jia J B, Yang X R, Dong S J, Wang E K. Electrophoresis, 2002, 23: 3692~3698
20 Auriola S, Martinsen A, Oksman-Caldentey K M, Naaranlahti T.J. Chromatogr., 1991, 562: 737~744
21 Nogrady T. Medicinal Chemistry. New York: Oxford University Press, 1985, 395
Determination of Alkaloids in Henbane by Capillary Electrophoresis
(CE) with Ru(bpy)3
2+ Electrochemiluminescence Detection
Qian Xiang1 , Ying Gao*1,2
a (Department of Applied Chemistry, Changchun Institute of Technology, Changchun 130021)
b (State Key Laboratory of Electroanalytical Chemistry, Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences,
Changchun 130022)
Abstract
Capillary electrophoresis with Ru(bpy)3
2+ electrochemiluminescence detection was established to the
determination of the alkaloids in henbane. Parameters related to the injection，separation and detection were
optimized. Under the optimized conditions, ECL detection at 1.2 V, 50 mmol/L phosphate buffer at pH 7.48 in the
detection cell, phosphate buffer at pH 8.48 as running buffer, injection voltage 12 kV, injection time 9 s, the
standard curves were linear between 0.29 and 5.8 mg/L for atropine and between 3.0 and 303 mg/L for
scopolamine, respectively. Detection limits of 0.014 mg/L for atropine and 0.03 mg/L for scopolamine were
obtained. Compared with traditional analytical method, the present method displayed advantages of sensitivity,
selectivity, linearity and small sample consumption. Due to an advanced anti-jamming capability of ECL detection,
a satisfactory result was achieved for the detection of drugs in herbs containing a large amount of coexistent
substances. Developed method was successfully applied to determine the alkaloids in henbane.
Keywords: Capillary electrophoresis; Electrochemiluminescence; detection; henbane

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