苗药痛风停对SD大鼠急性痛风性关节炎的影响
【摘 要】目的：观察苗药痛风停对尿酸盐结晶诱导的SD模型大鼠急性痛风性关节炎的关节肿胀度、步态分级、滑膜病理、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响，探讨苗药痛风停对急性痛风性关节炎的作用机制。方法：将60只SD大鼠随机分为空白对照组，苗药痛风停低、中、高剂量组，双氯芬酸钠组，模型对照组，每组10只。除空白对照组外，其余分别建立以尿酸盐结晶诱导的大鼠急性痛风性关节炎模型，分别观察和测量造模前及造模后6，12，24，48 h大鼠关节横径，并计算关节肿胀度;观察大鼠24，48 h步态分级;造模后48 h处死大鼠，用酶联免疫吸附法测定细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。结果：各治疗组对大鼠关节肿胀度、步态分级、滑膜病理改变和IL-1β、IL-6、TNF-α的表达有不同程度的改善，苗药痛风停中、高剂量组与双氯芬酸钠组比较，差异无统计学意义(P > 0.05)。结论：苗药痛风停能够改善尿酸盐结晶诱导的SD模型大鼠急性痛风性关节炎关节肿胀度、步态分级及滑膜病理改变;苗药痛风停降低尿酸盐结晶诱导的SD模型大鼠细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表达，以中、高剂量作用明显，并呈剂量依赖性。
【关键词】 痛风性关节炎;细胞因子;苗药痛风停;尿酸盐;实验研究
痛风(gout)是体内嘌呤代谢紊乱及/或排泄减少导致尿酸盐(monosodium urate，MSU)沉积所引起的晶体性关节病。痛风在我国的患病率约为0.15%～0.67%，较以前有明显升高[1]。痛风性关节炎常常合并有心血管疾病、高血压、2型糖尿病、肥胖、高脂血症、代谢综合征、慢性肾脏疾病和肾结石等[2]，而这些合并症往往是NSAIDs和/或秋水仙碱常见的禁忌症[3]。细胞因子白细胞介素IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等的高表达可导致、加重MSU结晶诱导的急性炎症的发生和发展[4]。中医学对痛风治疗有深入的认识，积累了丰富的'临床经验。苗药痛风停根据中医理论和苗医理论对痛风认识的结合而遣方组药，由白虎加桂枝汤加减苗药组成，通过本课题组多年临床观察、临床研究和实验研究，其治疗急性痛风性关节炎疗效显著，安全性好，缓解痛风性关节炎效果明显，并具有降尿酸作用[5-7]。在前期实验研究中，笔者已经证实苗药痛风停能够抑制SD大鼠急性痛风性关节炎IL-8、环氧化酶-2(COX-2)的表达，减轻关节滑膜炎症[8-9]。本文旨在探讨苗药痛风停对IL-1β、IL-6和TNF-α的影响。
1 实验材料
1.1 实验动物 清洁级健康雌雄SD大鼠60只，体质量(200±20)g，由重庆滕鑫生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(渝)2014-0009。
1.2 主要试剂及仪器 尿酸钠(美国Sigma公司，批号BCBH7155V);吐温80(美国Amresco公司，批号20090120);多粘菌素B(美国Amresco公司，批号2013105156);氨基酸乙脂(上海伊卡生物技术有限公司，批号EK131219);质量分数为4%的多聚甲醛溶液(上海博谷生物科技有限公司，批号PT028);IL-1β ELISA检测试剂盒(上海研辉生物科技有限公司，批号CK-E30419R);IL-6 ELISA检测试剂盒(上海研辉生物科技有限公司，批号CK-E30646R);TNF-α ELISA检测试剂盒(上海研辉生物科技有限公司，批号CK-E30635R);酶标仪(美国BioTek有限公司，批号Synergy TM);显微镜(日本OLYMPUS公司，批号BX51T-PHD-J11);CMOS(日本OLYMPUS公司，批号BX51T-PHJ-D17);切片机(德国Leica公司，批号RM2015);冷冻离心机(北京离心机厂，批号LDZ5-2型);电子天平(瑞士METTER，批号AE100型);低温冰箱(日本SANYO公司，批号MDF-382E型);电子游标卡尺：贵阳中医学院基础实验室提供。
1.3 实验药物 苗药痛风停由生石膏15 g、知母12 g、黄柏12 g、川萆薢10 g、薏苡仁12 g、砂仁12 g、川牛膝15 g、甘草6 g等，加苗药观音草12 g、芭蕉根12 g、络石藤15 g、大血藤15 g等组成。以上生药均购于贵阳中医学院第二附属医院。取上药煎汤浓缩，质量分数按实验需求的低、中、高分组分别浓缩至1.54，3.08，6.16 g・mL-1，置于4 ℃冰箱保存。双氯芬酸钠缓释片(四川花新制药有限公司，批号H19991402)，临用时将药片充分研磨后用无菌蒸馏水配制成混悬液，然后配制成1.54 mg・mL-1的混悬液备用。
2 方 法
2.1 实验动物分组 将60只SD大鼠随机分为空白对照组，苗药痛风停低、中、高剂量组，双氯芬酸钠组，模型对照组，每组10只。
2.2 造模方法 将大鼠步态分级[10-11]作为各组SD大鼠的筛选标准，未达到0级标准的SD大鼠则剔除不用。具体造模方法：依据Mc Carty DJ[12]的经典造模方法，先用质量分数为20%的乌拉坦(5 mL・kg-1)腹腔注射麻醉，然后常规消毒大鼠右侧膝关节皮肤，稍弯曲膝关节，从关节正中或侧方用6号注射针进针，将尿酸钠溶液10 mg(0.4 mL)及多粘菌素B 0.1 mL(10 U・mL-1)注入大鼠膝关节腔，空白对照组予相同剂量的生理盐水关节腔注射。整个实验过程中，有3只大鼠因灌胃不当死亡，2只大鼠因麻醉过深死亡，为保证样本数量，及时填补。
2.3 给 药 各组SD大鼠在相同条件下自由饮食1周后，开始灌胃。根据成人与大鼠用药等效剂量换算，中剂量等于将成人用药剂量换算为大鼠用药剂量，中剂量减半则为低剂量，中剂量加倍则为高剂量。苗药痛风停低、中、高剂量组分别按质量分数不同每只灌胃2 mL，即低、中、高剂量组分别为每只1.54，3.08，6.16 g・d-1;双氯芬酸钠组灌胃剂量每只2 mL，即每只2.08 mg・d-1;空白对照组及模型对照组予以等体积的生理盐水灌胃。各组大鼠连续灌胃3 d及造模前1 h进行灌胃，每日1次。最后一次灌胃后1 h，按上述造模方法造模。造模后继续给药，每日1次，直至大鼠处死。
2.4 标本取材 将大鼠用质量分数为20%的乌拉坦(5 mL・kg-1)腹腔注射麻醉后，股动脉放血约4～6 mL，静置约1 h后，以2500 r・min-1速度离心30 min，分离血清，用于ELISA检测。大鼠放血后，将其处死，进行常规消毒，沿后肢右膝关节正中纵行剪开皮肤，暴露出膝关节，打开膝关节腔，用眼科剪取完整的关节滑膜组织，用PBS水清洗去除血迹后，置于1.5 mL预冷的离心管中，然后加用质量分数为4%的多聚甲醛约1 mL固定，迅速冻存在-80 ℃冰箱中。