过量碘化物对原代培养的猪甲状腺细胞凋亡的作用
作者：田英娟，田园，刘超，叶亮
【摘要】 目的 观察过量碘化物对原代培养的猪甲状腺细胞凋亡的诱导作用，并对机制作初步探讨。方法 取健康的猪甲状腺细胞培养24h后，加入不同浓度的碘化钾(KI)，观察细胞的形态改变；琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术分析细胞DNA的降解；MDA法测定细胞膜的脂质过氧化程度。结果 加入KI 24h后，荧光染色镜下观察可见凋亡细胞；琼脂糖凝胶电泳呈梯状带；流式细胞术见亚二倍体（凋亡）峰，细胞凋亡率和脂质过氧化产物随碘化物浓度的升高而升高(P<0.05)。结论 过量碘化物诱导了原代培养的猪甲状腺细胞凋亡，可能通过活性氧机制启动凋亡。
【关键词】 甲状腺细胞凋亡；过量碘；活性氧
【Abstract】 Objective To study the effect of excess iodide on the primary cultured pig and its mechnism. Methods We employed the primary cultured pig thyroid cells. The apoptosis was evaluated by AQ-stained fluorescin， DNA ladder by gel electrophoresis and subdiploidy by propidium iodide-stained flow cytometry. The level of lipid peroxide under KI treatment was determined by measuring the production of thiobarbituric acid reactive substances.Results Thyroid cells treated with iodide excess at different concentration underwent apoptosis. Iodide displayed a dose-dependent apoptosis index and a dose-dependent generation of TBARS levels.Conclusion Iodide excess induce the apoptosis in the primary cultured pig thyroid cells. This type of apoptosis seems to be activated by reactive oxygen species.
【Key words】 thyroid cell apoptosis；iodide excess；reactive oxygen species
碘化物在人类的日常生活中具有重要的意义。过量碘化物对甲状腺及培养的甲状腺细胞的毒性效应早已证实，近几十年来从凋亡角度对这种作用作了一些研究［1～3］。目前过量碘化物对体外培养的猪甲状腺细胞的作用未见报道，其诱导甲状腺细胞凋亡的机制尚未阐明。本实验观察过量碘化物对原代培养的猪甲状腺细胞凋亡的诱导作用，并对凋亡机制作初步研究。
1 与方法
1.1 主要试剂与仪器 F-12培养基为美国Gibco公司生产，促甲状腺激素(TSH)、胶原酶为美国sigma公司生产，荧光显微镜为日本Olympus BH-2型，流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品。
1.2 甲状腺细胞培养 取适量的猪甲状腺组织(锦州肉联厂提供)PBS冲洗，剪碎倒入带有磁力搅拌子的三角烧瓶中，加入双酶消化；每隔15～20min取出上2/3的消化液，漂洗制成细胞悬液；消化完毕将细胞悬液通过100目筛网过滤，调整细胞数106/ml，接种于培养板上；置5%二氧化碳孵箱，在10%FCS、1u/LTSH的F-12培养基中培养，每2～3天更换培养基。
1.3 实验分组 甲状腺细胞正常培养24h后，加入处理因素并分组。空白对照组：不加其他处理因素；阳性对照组：放线菌酮（CHX）2×10-3g/L(终浓度)；阴性对照组：氯化钾60mmol/L(终浓度)；实验组：不同浓度的KI。所用浓度根据多次预实验的结果并参考文献资料［1］。
1.4 甲状腺细胞的形态学观察 在倒置显微镜下，观察各组培养细胞的形态及生长状况。培养24h后加入处理因素，再过24h收集细胞，经吖啶橙（AO）染色在荧光显微镜下观察。
1.5 琼脂糖凝胶电泳 取实验组（KI 1mmol/L，60mmol/L， 100mmol/L）、阴性对照组、阳性对照组同时做电泳。加入处理因素再培养24h后收集细胞，分别加入细胞裂解液、RNA酶、样品缓冲液混匀后，加样于1%琼脂糖凝胶的样品孔，电泳结束观察并记录。
1.6 细胞凋亡率和脂质过氧化测定 实验设6个不同的浓度组，加入KI再培养24h后收集细胞。用预冷的70%乙醇固定细胞，加入碘化丙啶（PI）染液后，流式细胞仪分析各组细胞DNA的含量分布；超声震碎细胞，按南京建成生物公司提供的方法检测MDA含量。亚二倍体峰（凋亡）细胞比率表示细胞的凋亡率。
1.7 学分析 实验所得数据用均数±标准差表示，应用统计软件SPSS11.5进行单因素方差分析。
2 结果
2.1 甲状腺细胞的形态学观察 甲状腺细胞是腺体上皮细胞，20～24h贴壁生长，细胞呈多边形、圆形；２～3天可见典型的滤泡结构，5～6天细胞铺满单层。加入KI ６～8h滤泡结构开始改变，细胞有分散倾向；24h后无典型滤泡结构，有的'细胞变小、变圆，核内出现碎片；48h后可见漂浮的细胞，以后改变不明显。
2.2 细胞凋亡的荧光显微镜观察 阳性对照组及实验组的凋亡细胞核内可见致密浓染的黄绿色染色，呈圆形、月牙形，可见发泡现象及凋亡小体。阴性对照组细胞核内呈均匀的黄绿色染色。
2.3 琼脂糖凝胶电泳 电泳结果显示：阳性对照组、KI组见明显的凋亡条带，呈云梯状；高浓度的梯状带较明显。阴性对照组无云梯状带(见图1)。
2.4 细胞凋亡率测定 流式细胞仪分析表明在不同KI浓度组DNA直方图上显示：随浓度的升高二倍体峰（G0/ G1期）细胞减少（P<0.05），亚二倍体峰（凋亡）细胞升高（P<0.05）。见表1。
2.5 脂质过氧化程度测定 培养细胞加入过量的KI后，脂质过氧化产物MDA的量随浓度的升高而升高（P<0.05）。见表2。
表1 在不同浓度KI作用下凋亡细胞（Ap）、G0／G1细胞所占比率 （%，±s）
注：不同浓度的KI组间比较，*P<0.05，△P＞0.05
表2 不同浓度碘化钾作用下MDA含量 （nmol/mg，±s）
注： 不同浓度的碘化钾组间比较，*P<0.05
2.6 相关性分析 从培养甲状腺细胞的细胞脂质过氧化产物MDA与细胞凋亡率的散点图上可见，细胞脂质过氧化水平与细胞凋亡率呈显著正相关，r=0.993，P<0.01。
3 讨论
自然界中与甲状腺激素合成有关的碘主要是碘化钠、碘化钾。碘化物在人类的日常生活中具有重要的意义，但过量碘化物对在体甲状腺组织及培养的甲状腺细胞都存在毒性效应［1～4］。本实验猪甲状腺细胞培养24h，加入过量碘化钾，甲状腺滤泡及细胞形态出现改变，细胞发生凋亡，反映了过量碘化物的细胞毒性效应。过量碘化物的这种毒性效应机制至今尚未阐明。
细胞坏死和凋亡是细胞两种截然不同的死亡方式，但在某些情况下二者的区分较困难，尤其对培养细胞。当以细胞凋亡诱导剂进行凋亡诱导时，开始细胞以凋亡为特征，随着诱导时间的延长或诱导剂浓度的增加，凋亡后期的细胞发生继发性死亡的改变，称为细胞凋亡性坏死，即凋亡细胞出现肿胀、空泡化，甚至胞膜发生破裂［5］。过量碘化物引起培养甲状腺细胞形态、超微结构、电位的改变，是细胞凋亡在不同阶段的表现形式［1～4］。Vitale等研究过量碘化钾对体外培养的甲状腺TAD-2细胞系及人正常甲状腺细胞的作用，认为在实验中出现的甲状腺细胞凋亡和坏死，是一个细胞凋亡的过程，坏死是细胞凋亡性坏死［1］。本实验中过量碘化钾诱导了原代培养的猪甲状腺细胞凋亡；且细胞凋亡率随浓度的升高而上升，呈剂量依赖关系，与Vitale的报道相符。
人们早已发现丙基硫氧嘧啶、甲硫咪唑、高氯酸等抑制过量碘化物对甲状腺细胞的毒性作用，阻滞细胞的坏死和凋亡［1，4］。推断碘离子的代谢过程可能与碘化物诱导的细胞凋亡有关。甲状腺滤泡上皮细胞可浓缩I-，过氧化物酶在氧化I-过程中生成活性很高的自由基引起质膜中脂质过氧化，导致线粒体内活性氧的产生并释放，诱导细胞凋亡。本实验中MDA、细胞凋亡率均随碘化物浓度的升高而升高，推测加入过量碘化钾后，质膜中脂质过氧化导致活性氧的释放，诱导培养的甲状腺细胞凋亡，其途径可能通过活性氧机制。过量碘化物诱导的甲状腺细胞凋亡的过程中，检测到的细胞色素C、活性