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银杏黄酮对D-半乳糖衰老模型小鼠的作用
作者：窦丽华，马玉奎，丁元升
【摘要】 目的 研究银杏黄酮对D-半乳糖所致小鼠学习记忆能力下降和各项衰老指标的对抗作用，以期探讨银杏黄酮的抗衰老作用机制。方法 以D-半乳糖衰老模型小鼠为实验对象，以其体重、免疫器官重量、肝脑丙二醛(MDA)和脂褐素(LF)的含量，全血谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-PＸ）、红细胞过氧化氢酶(CAT)和脑中超氧化物歧化酶(SOD)的活力，脑中谷氨酸水平为指标，全面考察银杏黄酮的抗衰老作用。结果 银杏黄酮(125、250、500mg/kg，ig)，能对抗连续6周给5%D-半乳糖0.25ml/10g所致小鼠脑组织中LPO、LF含量的升高，提高全血GSH-PＸ、红细胞CAT和脑中SOD的活力，并对抗小鼠体重、脾脏及胸腺指数下降。结论 银杏黄酮能有效地对抗D-半乳糖所致的小鼠多项衰老指标的出现，促进衰老小鼠的学习记忆能力。
【关键词】 银杏黄酮；D-半乳糖；衰老；小鼠；L-谷氨酸
【Abstract】 Objective By using the D-galactose-induced aging mice，the effects and mechanism of Ginkgo flavone on aging were investigated.Methods Ginkgo flavone were given to mice by ig and D-galactose were injected into mice for six weeks.Then，the ability of study of mice，the content of LPO，LF and the L-glutamate，the body weight，the index of thymus and spleen，the activities of superoxide dismutase(SOD)，catalase(CAT)and whole blood glutathione peroxidase(GSH-PＸ)were determined.Results To the D-galactose-induced aging mice，Ginkgo flavone(125，250，500mg·kg－１，ig)reduced the content of LPO，LF，L-glutamate in brain，inhibited the decrease of body weight and the weight of thymus and spleen，enhance the activities of SOD in brain，CAT in erythrocyte and whole blood GSH-PＸ.Conclusion Ginkgo flavone shows a remarkable anti-aging effect on the D-galactose-induced aging mice.
【Key words】 Ginkgo flavone； aging； D-galactose； mice； L-glutamate
银杏黄酮(Ginkgo flavone)是从中草银杏中提取分离的有效成分，及基础研究［１，２］表明，银杏黄酮对衰老和老年性痴呆有一定的治疗作用，认为作用机制可能是使衰老动物和老年性痴呆人脑组织中M１受体上调。但衰老是个综合过程，涉及机体各个系统、不同结构层次的多项指标。目前银杏黄酮对老化相关酶、老化代谢产物的影响报道尚少，特别是谷氨酸和衰老的关系是近几年研究的热点［３］。本文采用D-半乳糖衰老模型小鼠考察了Ginkgo flavone 对上述多项指标的影响，同时测定动物学习记忆能力的变化。
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1.1 动物 昆明种小鼠［合格证号：SCXK(鲁)20030004］♂，体重18～22g，由山东大学实验动物中心提供。
1.2 药品与试剂 银杏黄酮(Ginkgo flavone)：沈阳药科大学植化教研室提供。D-半乳糖：Sigma公司生产，上海生化试剂公司分装，批号：980927。硫代巴比妥酸(Thibarbituric acid，TBA)：上海制剂二厂，批号：920620。苄胺(Benzyl amine)：新华活性材料研究所，批号：20000123。谷胱苷肽(GSH)：上海政翔医用科技实业服务部化学试剂研究所，批号：990915。二硫硝基苯(dithionitobenzene；DTNB)：FLUKA产品，批号：980716。L-谷氨酸：上海康达氨基酸厂产品，批号：20000531。茚三酮：上海试剂三厂产品，批号：990325。GSH-PＸ、CAT、SOD测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所提供，批号：20030225。
1.3 仪器 WFZ800-D2型紫外可见分光光度计，北京第二光学仪器厂；HITACHI650-60型荧光分光光度计，日本；电泳仪，DYY-Ⅲ型，北京六一仪器厂；721分光光度计，上海第三分析仪器厂；910双波长薄层扫描仪，日本岛津公司。
2 方法
2.1 D-半乳糖衰老模型的建立［４］ 取健康♂小鼠75只，随机分为正常组、模型组、给药组。各给药组ig Ginkgo flavone(125、250、500mg/kg)；正常组和模型组ig等体积的CMCNa；给药同时模型组和各给药组皮下注射5%D-半乳糖0.25ml/10g；正常组皮下注射等体积的生理盐水；连续6周，最后1天灌胃和注射D-半乳糖2h后，进行学习记忆训练实验，次日测定记忆成绩。然后处死，测定各项衰老指标。
2.2 D-半乳糖衰老模型小鼠学习记忆能力的测定(跳台法)［５］ 将动物放入跳台箱内适应3min，然后立即通36V交流电。动物受到电击，其正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激，如此训练5min。24h后重做测验，此即记忆保持测验。记录小鼠第1次跳下平台的潜伏期和5min内的错误次数。
2.3 D-半乳糖衰老模型小鼠脑组织MDA、LF含量测定［４］小鼠断头处死，立即取脑，用硫代巴比妥酸(TBA)法测定组织丙二醛(MDA)的含量；用荧光法测定脑组织中LF的含量。
2.4 D-半乳糖衰老模型小鼠全血GSH-PＸ、红细胞CAT和脑中SOD活力的测定 小鼠末次给药后第2天眼眶取血，断头处死取全脑，分别按试剂盒说明测定GSH-PＸ、CAT和SOD。
2.5 小鼠脑组织中谷氨酸含量的测定［６］ 小鼠断头处死，立即取全脑适量，用0.61mol/L的三氯乙酸制作10%的匀浆，取上清液用石油醚-正丁醇洗后，点样，电泳，茚三酮显色后用双波长薄层扫描仪测定全脑谷氨酸的含量。
2.6 学方法 各组数据采用x±s表示，组间比较采用t。
3 结果
3.1 银杏黄酮对衰老模型小鼠体重及免疫器官重量的影响 与正常组比较，衰老模型小鼠体重及胸腺和脾脏指数降低，而银杏黄酮(125、250、500mg/kg)可显著抑制体重、胸腺和脾脏指数的降低，见表1。
Tab 1 The effect of Ginkgo flavone on the index of body weight，thymus and spleen of D-galactose-induced seniled mice （x±s，n=15）
注：＃＃P＜0.01，compared with control group；**P＜0.01，*P＜0.05，compared with model group
3.2 银杏黄酮对衰老模型小鼠学习记忆的影响 与正常对照组相比，模型组小鼠记忆明显衰退，表现为错误次数增加，潜伏期缩短(均P＜0.01)。与模型组比较，银杏黄酮(125，250，500mg/kg)可使小鼠错误次数明显减少，潜伏期明显延长，见表2。
Tab 2 The effect of Ginkgo flavone on the eeficit of learning and memory induced by D-galactose on mice in step-down tese (x±s，n=15)
注：＃＃P＜0.01，compared with normal group；*P＜0.05，**P＜0.01，compared with model group
3.3 银杏黄酮对D-半乳糖致小鼠衰老模型脑内LPO、LF、含量的影响 与正常组比较，衰老模型小鼠脑组织中LPO、LF、含量增高，而银杏黄酮(125、250、500mg/kg)可显著抑制LPO、LF含量的增高，见表3。
Tab 3 Effect of Ginkgo flavone on the content of LPO and LF on D-galactose-induced seniled mice (x±s，n=15)
注：＃＃P＜0.01 compared with control group；*P＜0.05，**P＜0.01，compared with D-galactose group
3.4 银杏黄酮对D-半乳糖致衰老模型小鼠全血GSH-PＸ、红细胞CAT和脑中SOD活力的影响 与正常组比较，衰老模型小鼠全血GSH-PＸ、红细胞CAT和脑中SOD活力明显降低，而银杏黄酮(125、250、500mg/kg)可显著抑制3种酶活力的降低，见表4。
Tab 4 Effect of Ginkgo flavone on the activity of SOD of brain，CAT of erythrocyte and GSH-PX of blood in D-galactose-induced seniled mice. (x±s，n=15)
注：＃＃P＜0.01，＃P＜0.05，compared with control group；*P＜0.05，compared with D-galactose group
3.5 银杏黄酮对D-半乳糖致衰老模型小鼠全脑谷氨酸含量的影响
与正常组比较，衰老模型小鼠全脑谷氨酸含量增加，而银杏黄酮(125、250、500mg/kg)可显著抑制谷氨酸含量的增加，见表5。
Tab 5 Effect of Ginkgo flavone on the content of L-glutamate of brain，in D-galactose-induced
注：＃P＜0.05，compared with control group；*P＜0.05，compared with D-galactose group
4 讨论
D-半乳糖亚急性衰老模型是利用给小鼠连续皮下注射大剂量D-半乳糖，造成动物糖代谢紊乱而建立的。D-半乳糖在半乳糖氧化酶催化下，可产生超氧阴离子等氧自由基。氧自由基具有高度活性，可以攻击膜磷脂中的不饱和脂肪酸、蛋白质、酶及胞核内的DNA等；自由基还可使脂质发生过氧化作用而形成过氧化脂质(LPO)，LPO随蛋白沉淀后在酸性条件下生成MDA，MDA是活泼的交联剂，可迅速与磷脂酰乙醇胺生成荧光色素，然后与蛋白质、肽类、脂类结合形成板层状脂褐质(LF)。用D-半乳糖连续注射，小鼠可产生多项生化指标的变化，如脑组织MDA、LF含量的升高；脑中SOD、血中GSH-PＸ、红细胞中CAT活力的降低，这些变化和自然衰老的变化相一致，说明D-半乳糖可引起细胞和机体的衰老［７，８］。SOD、GSH-PＸ、CAT活性间接反映机体清除氧自由基的能力；而MDA、LF水平高低间接反映细胞受自由基攻击的严重程度。
谷氨酸是中枢神经系统中一种重要的神经递质。研究表明，自然衰老动物脑中谷氨酸含量增加，此物质持续激活N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate；NMDA)受体，使细胞外Ca２＋内流，细胞内Ca２＋超载，产生大量的自由基，导致神经系统损伤；如脑组织中一些特殊神经元被破坏，其功能丧失可加速衰老过程，最终导致多种衰老体征的出现。因此，Poeggeler［３］认为谷氨酸的增多与衰老有密切联系，大致可概括：谷氨酸-自由基-衰老。本实验结果表明，与正常组相比，模型小鼠脑中谷氨酸含量增加，进一步证明D-半乳糖模型的实用性和全面性，脑内谷氨酸含量可作为一种新的衰老指标，用于抗衰老物的研究。
本研究表明：银杏黄酮可以有效对抗D-半乳糖所致的小鼠亚急性衰老和学习记忆能力的降低，具有抗衰老作用。其抗衰老的机制可能是通过提高机体SOD、GSH-PＸ、CAT等抗氧化酶活力，减少兴奋性神经递质-谷氨酸的含量，从而对抗自由基对细胞的损伤，降低LPO、LF等代谢产物的产生而有效地对抗D-半乳糖所致的小鼠衰老体征的出现和学习记忆能力的下降。
【参考文献】
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6 程秀娟，陈闽芳，马艳.纸电泳-双波长扫描法测定超氧化物歧化酶活性的改进.生物化学杂志，1985，18(2)：38-40.
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8 李文斌，韦丰，范明，等.半乳糖在小鼠上诱导的拟脑老化效应.中国药与毒理学杂志，1995，9(2)：93-95.
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