褪黑素对PTZ致痫大鼠海马神经元凋亡的影响
【摘要】 目的 探讨褪黑素对癫痫发作中细胞凋亡的影响。方法 将24只成年Wistar大鼠(180～230g)随机分为NC组、PTZ组和MT组；PTZ组和MT组腹腔注射PTZ(60mg/kg)，诱导癫痫发作，NC组腹腔注射等量生理盐水。MT组按体重10mg/kg于注射PTZ之前20min、立即、后1h、后2h分别经腹腔注射MT并观察1h，PTZ组于相同时间注射生理盐水。然后处死大鼠取脑，应用免疫组织化学的方法检测海马神经元Bax和Bcl-2蛋白的表达。结果 大鼠海马神经元Bax的改变：PTZ组明显高于NC组，MT组明显低于PTZ组，但高于NC组：大鼠海马神经元Bcl-2的改变：PTZ组明显高于NC组，MT组明显高于PTZ组，也高于NC组。结论 MT可以通过增强海马神经元Bcl-2的表达和降低Bax的表达而对抗癫痫中细胞的凋亡。【关键词】 褪黑素；癫痫；戊四氮；Bax；Bcl-2
【Abstract】 Objective To explore the effect of melatonin on bcl-2 and bax of hippocampus in seizures rats induced by PTZ.Methods Twenty-four adults Wistar rats (180～230g) were randomly divided into three groups，NC group，PTZ group and MT group.A dose of PTZ(60mg/kg)was intraperitoneally injected into the rats of PTZ group and MT group and seizures was induced.The rats of NC group were administered with the same dose of normal saline.The rats of MT group were administered intraperitoneally with MT(10mg/kg)in 20 minute before injecting PTZ，at one time，1 and 2 hour after injection.Simultaneously the same dose of noraml saline was administered intraperitoneally on PTZ group.The rats were killed.To study the influence of MT on Bcl-2 and Bax immunoreactivity of neruon on hippocampus by using immunohistochemistry method.Results The number and optical density of Bax in hippocampus of PTZ group rats was higher than that of control group rats.The number and optical density of Bax in hippocampus of MT group rats was lower than that of PTZ group rats，was higher than that of control group rats；The number and optical density of Bcl-2 in hippocampus of PTZ gorup rats was higher than that of control group rats；The number and optical density of Bcl-2 in hippocampus of MT group rats was higher than that of PTZ group rats，was higher than that of control group rats.Conclusion Melatonin can resistant the apoptosis of hippocampus neruon by increased the expression of Bcl-2 and decreased the expression of Bax.
【Key words】 melatonin；seizure；pentylenetetrazole；bax；bcl-2
难治性癫痫是神经系统的常见病，发病机制至今没有完全阐明，癫痫长期发作可能造成患者的智力和认知发生改变，给和家庭带来沉重的负担。大量动物实验发现癫痫发作后中枢神经系统存在细胞凋亡，临床癫痫病人也大多有海马硬化存在。褪黑素(Melatonin，MT)是松果体分泌的神经内分泌激素，它对人体的作用非常广泛，近年研究发现它具有抗癫痫发作的报道［1］，但是它是否对癫痫发作后神经细胞的凋亡具有保护作用研究较少，本实验旨在通过观察MT对戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)点燃大鼠海马神经元的Bcl-2和Bax的影响，借以了解其对神经元细胞凋亡的保护作用，弄清它在治疗癫痫中的进一步作用机制。
1 与方法
1.1 材料 戊四氮及多聚甲醛均为Sigma公司产品，兔抗Bcl-2和Bax抗体购自北京中山试剂有限公司，Wistar大鼠由华中科技大学同济院动物中心提供，羊抗兔抗体和DAB染色剂购自武汉博士德公司，褪黑素购自Alexis公司。
1.2 MT的制备 MT临用前用无水乙醇溶解，再加生理盐水配制，使乙醇的浓度为5%。
1.3 动物饲养与分组 提前1w将大鼠饲养在12h光照(7：00～19：00)12h黑暗(19：00～7：00)安静的，自由摄食进水，24只健康雄性Wistar大鼠(320～380g)，随机分为三组：一组为PTZ致癫痫组(PTZ组)；一组为MT干预组(MT组)；一组为正常对照组(NC组)，每组8只。PTZ组和MT组各8只，经腹腔注入戊四氮(60mg/kg)诱导癫痫发作，并观察行为学变化。MT组按体重10mg/kg于注射PTZ之前20min、注射后立即、后1h、后2h分别经腹腔注射MT并观察1h，PTZ组于相同时间注射等量含5%乙醇生理盐水。然后，3组全部行心脏灌注固定取材。
1.4 灌注与取材 动物先用10%的水合氯醛(0.3g/kg)腹腔注射麻醉，麻醉显效后开胸在直视下将穿刺针自左心室插入主动脉，自右心房剪口放血，先快速注入约150ml生理盐水，然后滴注4%的多聚甲醛500ml，先快后慢，持续约1h，然后断头取脑，取出脑组织后修块(含海马)，将组织块放入4%多聚甲醛中，2～4h后取出，放入20%的.蔗糖中过夜，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，片厚4μm。
1.5 免疫组织化学方法(S-P法) 每只动物取8张脑片，4张用于Bax，4张用于Bcl-2。具体步骤如下：(1)切片常规脱腊入水，PBS(pH 7.4)洗3次，每次3min。(2)高压修复抗原，将切片浸入0.01M的枸橼酸缓冲(pH 6.0)，高压加热，喷气后2min。(3)每张切片滴加1滴过氧化酶阻断溶液，37℃孵育10min，以阻断内源性过氧化酶的活性。PBS洗3次，每次3min。(4)每张切片滴加1滴正常山羊血清封闭液，室温孵育15min。(5)每张切片滴加1滴兔抗Bax和Bcl-2抗体，4℃过夜。(6)PBS洗三次，每次3～5min。(7)除去PBS液，每张切片滴加1滴链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，37℃孵育25min。PBS洗三次，每次3min。(8)除去PBS液，每张切片滴加2滴新鲜配置的DAB溶液，显微镜下观察3min。(9)自来水冲洗，苏木素复染，PBS冲洗返蓝。(10)切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
1.6 图像分析和数据处理 每只鼠取8张脑片，其断面水平各鼠均相似，应用HPIAS200彩色病理图文分析系统进行图像分析。所有脑片均在同一放大倍数(×200)、同一光强度下分析。首先分析海马内Bax和Bcl-2平均阳性细胞计数，然后对所选脑区进行阳性反应细胞平均光密度测定。
1.7 学处理 结果用x±s表示。应用SAS统计软件包分析(医院统计室提供)。
2 结果
2.1 行为学变化 PTZ组在注射戊四氮后平均1.5min出现眨眼、动须、节律性点头、肢体抽搐、跌倒等，其中8只出现Ⅴ级发作。MT组在给后平均12min出现眨眼、动须、节律性点头、肢体抽搐、跌倒等表现，2只出现Ⅴ级发作，3只出现Ⅳ级发作，1只出现Ⅲ级发作，1只出现Ⅱ级发作。行为学的判断标准按Racine法分为Ⅰ级：湿狗样颤动，面肌抽动、咀嚼；Ⅱ级：节律性点头；Ⅲ级：前肢阵挛；Ⅳ级：站立伴前肢阵挛；Ⅴ级：失平衡、倾倒、四肢抽动、全身阵挛。
2.2 免疫组织化学结果 海马Bax和Bcl-2平均阳性细胞计数，胞体平均光密度值见表1和表2，免疫反应的强弱用平均光密度值表示，颜色越深数值越大。PTZ组Bax平均阳性细胞计数和胞体平均光密度明显高于正常对照组，MT组明显低于PTZ组，但高于NC组。PTZ组bcl-2平均阳性细胞计数和胞体平均光密度明显高于NC组，VAP组明显高于PTZ组，也高于NC组。
表1 海马bax阳性细胞平均数目(N)和光密度(D)的比较 (x±s)
注：*P＜0.01 compared with NC group and PTZ group，
** P＜0.05 compared with NC group
表2 海马bcl-2阳性细胞平均数目(N)和光密度(D)的比较 (x±s)
注：*P＜0.01 compared with NC group and PTZ group，
** P＜0.05 compared with NC group
3 讨论
细胞凋亡是能量依赖的细胞内死亡程序活