全氟辛烷磺酸对大鼠兴奋性氨基酸影响
【摘要】 目的 探讨全氟辛烷磺酸（PFOS）与大鼠中枢神经系统兴奋性氨基酸的时间反应关系。方法 将成年Wistar大鼠随机分为1个对照组和4个实验组［25mg/（kg· bw），染毒后2,4,8,24h］；用PFOS对成年Wistar大鼠经口1次染毒；对照组给予等体积的2%吐温-80溶液。高效液相色谱法（HPLC）测定脑组织中谷氨酸、天冬氨酸、γ-氨基丁酸及甘氨酸含量变化。结果 谷氨酸2,4,8h含量分别为（0.89±0.162），（0.75±0.276），（0.84±0.542）μmol/（g·protein），与对照组（1.30±0.063）μmol/（g·protein）比较，差异有学意义(P＜0.05）。天冬氨酸无显著变化。甘氨酸8,24h含量分别为（1.24±0.352），（1.09±0.215）μmol/（g·protein），与对照组（1.54±0.120）μmol/（g·protein）比较，差异有统计学意义(P<0.05）。γ-氨基丁酸含量24h为（1.68±0.188）μmol/（g·protein），与对照组（2.03±0.370）μmol/（g·protein）比较，差异有统计学意义(P<0.05）。结论 低剂量PFOS染毒后中枢神经系统出现先抑制后兴奋的症状可能与兴奋性氨基酸的参与有关。
【关键词】 全氟辛烷磺酸
全氟辛烷磺酸（Perfluorooctane sulfonate，PFOS）是近年来引起学者密切关注的新发现的持久性环境有机污染物，具有难溶性、生物蓄积性和沿食物链向高位营养级的生物体内富集的作用〔1〕。研究表明,PFOS可引起恒河猴体重减轻、血液多种生理生化指标异常、肝细胞空泡化等改变〔2〕。PFOS的污染已遍及全球生态系统〔3〕。本实验旨在对低剂量PFOS暴露条件下，大鼠脑组织中的.谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸含量的时间变化进行测定，探讨PFOS神经毒性作用机制。
1 对象与方法
1?1 试剂与仪器 全氟辛磺酸钾盐（瑞士fluka公司），用2%吐温-80配制。邻苯二甲醛、氨基酸标准品谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸（美国Sigma公司）。醋酸钾为分析纯，甲醇为色谱纯。高效液相色谱仪为HP HEWLETT PACKARD SERIES-1100（日本惠普公司）；C18色谱柱（150mm×4.6mm 5μm）（美国Phenomenex公司）。超声波细胞粉碎机JY96-ⅡN（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
1?2 实验动物分组及处理 健康成年Wistar大鼠（中国医科大学动物实验中心）56只，体重190～220g，雌雄各半。随机分为5组，1个对照组（2%吐温-80溶液）和4个实验组PFOS染毒［25mg/(kg·bw)］，每组8只，经口灌胃染毒1次。染毒2,4,8,24h后采集脑组织，经2%戊巴比妥钠麻醉后，按设定时间将大鼠颈静脉放血处死，迅速断头，开颅取脑，在冰皿上分离脑组织,分别测定2,4,8和24h大鼠脑组织氨基酸含量。
1?3 样品制备 将分离的脑组织用预冷的生理盐水1∶9（w/v）匀浆5min，在冰水浴条件下超声脑组织，3500r/min，4℃离心20min，取上清100μl用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。另取上清1ml 10000r/min，4℃高速离心20min后，取其上清，以备氨基酸测定。
1?4 考马斯亮蓝法测定脑组织蛋白质含量 称取10mg小牛血清蛋白，溶于蒸馏水中，分别稀释配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1mg/L的标准品。分别取100μl待测样品加入考马斯亮蓝5ml，722分光光度计比色，测定待测样品中的蛋白质含量以备标定氨基酸。
1.5 邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生高效液相色谱荧光法检测氨基酸含量 标准液配制：分别用1mol/L 氢氧化钠溶液配制谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸及γ-氨基丁酸标准品1mmol/L的储备液，临时用1mol/L 氢氧化钠稀释配制成0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，100μmol/L的标准系列。衍生试剂配制：称取20mg邻苯二甲醛，0.5ml β-巯基乙醇溶于0.5ml甲醇中；再加入9ml 0.4mol/L硼酸缓冲液(pH为10.5); 超声溶解，新鲜配制，避光保存。衍生化反应：在室温下，吸取氨基酸标准液或样品液100μl，1mol/L氢氧化钠溶液100μl，加入邻苯二甲醛衍生试剂400μl，混匀静置2min后，进样30μl。
1?6 色谱条件 色谱柱：C18色谱柱（150mm×4.6mm 5μm），柱温为28℃。流动相A：0.1mol/L醋酸钾溶液，pH=5.89。流动相B：HPLC级甲醇。B相梯度洗脱条件：0～10min 10%→25%；12～19min 47%→60%；22～27min 100%→100%，28min 10%，平衡5min，30min结束洗脱。用安捷伦色谱工作站记录并分析结果，峰面积用外标法定量。荧光检测器，激发波长250nm，发射波长410nm。
1?7 统计分析 采用SPSS11.5软件进行方差分析。
2 结果
2?1 行为观察 PFOS染毒组大鼠在染毒2h后出现活动减缓，少动呆卧，嗜睡，24h后活动恢复正常。对照组未见异常改变。
2?2 色谱行为 在上述色谱条件下，标准液及大鼠脑组织中的谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸均得到良好分离。
2.3 不同PFOS急性染毒时间脑组织氨基酸含量变化比较（表1）
表1 PFOS暴露时间大鼠脑组织氨基酸含量的比较（略）
注：与对照组比较,* P<0.05
不同实验组的天冬氨酸含量无明显变化；谷氨酸含量在2,4,8h组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；4h组含量降至最低后逐渐升高，24h已恢复正常。而抑制性氨基酸甘氨酸含量8,24h组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；γ-氨基丁酸24h组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。
3 讨论
天冬氨酸与谷氨酸是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质，其释放增加可导致神经兴奋性或神经毒性作用增强。γ-氨基丁酸、甘氨酸被认为是重要的抑制性神经递质，具有降低中枢神经系统的兴奋性从而起到保护作用。实验结果显示，本实验建立的色谱条件下，标准品和待测样品中的4种氨基酸均得到良好分离。大鼠经低剂量的PFOS染毒后，γ-氨基丁酸、甘氨酸的含量缓慢降低，同时天冬氨酸与谷氨酸含量先降低后恢复，使大鼠行为表现为嗜睡、行动迟缓，与报道有所不同〔4〕，可能是染毒剂量不同所致。脑组织中兴奋性氨基酸总量的下降可能是与PFOS抑制兴奋性氨基酸的合成以及降解增加有关。谷氨酸反应迅速，持续时间短，恢复快，2h就开始降低，8h后逐渐升高，24h已恢复至正常水平。而γ-氨基丁酸、甘氨酸的作用缓慢，持续时间长可能是由于机体的负反馈调节机制作用所致，使PFOS对大鼠中枢神经系统的作用在24h内恢复。这种变化的具体机制以及神经系统中重要的信使兼递质分子一氧化氮、氧自由基、神经营养因子等是否参与PFOS的神经毒性机制有待进一步研究。
【参考文献】
〔1〕 Tomy GT,Budakowski W,Halldorson T,et al.Fluorinated organic compounds in an eastern Arctic marine food web［J］.Environ Sci Technol,2004,38(24):647-681.
〔2〕 Seacat AM,Thomford PJ,Hansen KJ，et al.Subchronic toxicity studies on perfluorooctanesulfonate potassium salt in cynomolgus monkeys［J］.Toxicol Sci,2002 ,68(1):249-264.
〔3〕 Giesy JP,Kannan K.Global distribution of perfluorooctane sulfonate in wildlife［J］.Environ Sci Technol,2001,35:1339-1342.
〔4〕 李莹，金一和.全氟辛磺酸对大鼠中枢神经系统谷氨酸含量的影响［J］.卫生毒理学杂志，2004,18(20):232-234.
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