放射性碘标记羟氨苄青霉素用于青霉素结合蛋白的研究

时间：2023-03-01 08:50:10 药学毕业论文我要投稿

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　　论文关键词青霉素结合蛋白，放射性，经氨苇青霉素多头泡噬厉，Mecillinam

　　论文摘要 本文报道用放射性对经氨节青霉素进行标记后用于青霉素结合蛋白(PBPs)的研究。结果表明，一经氨节青霉素能较好地与细菌内膜上所有的青霉素结合蛋白结合。进行竞争性结合实验，头抱嘎肪的主要靶位是PBP3，Mecnhnam的主要靶位是PBP:。我们建立的青霉素结合蛋白的测定方法，关键性的价廉易得，具有简便、快速、等优点，是一个值得继续开发和研究的新途径。

　　青霉素结合蛋白是存在于细菌被膜上一群能同青霉素和其它尽内酞胺类抗生素赘合的细菌蛋白，从分子水平上对青霉素结合蛋白的研究，对于探讨刀一内酞胺类抗生素的作用机制和阐明某些细菌的耐机制具有重要的意义，国内外已进行了多方面的研究（1-5）。我们从大肠杆菌K:，中提取细菌膜蛋白，利用放射性’肠碘建立了细菌青霉素结合蛋自的检测方法，现报告如下。

　　实验材料

　　一、抗生素:

　　经氨节青霉素(Amox了eillin)，头抱唾肪(Cefotaxime)和Meeillinam均为市售产品。

　　二、菌株:

　　大肠杆菌K12、:为北京生物制品检定所提供。

　　三、培养基:

　　采用抗Ⅲ号培养基。

　　四、放射源:

　　一Nal由北京原子能所提供。

　　实验方法

　　一、一袅氛节青霉素的制备:

采用氯胺一T法，在参考Masson等（6）的基础上加以改进。、氢氨节青霉素20拌g和氯胺一混合，在室温条件下反应60~90秒后加入偏重亚硫酸钠和碘化钾完成整个反应，将标记品稀释至反应所需浓度后放入O~4℃存放。

　　二、结合反应:

　　细菌培养及膜的制备参照Spratt等（7）的方法制得。在反应管中加入提取的膜蛋自一经氨节青霉素，30℃温育10分钟，加入青霉素Go.6mg，20%的+二烷基肌氨酸10川，室温下放置20分钟，离心100，。009x4。分钟，将上清液、样品缓冲液和琉基乙醇按6:3:1的比例混合，沸水浴3分钟，冷却后经SDS一PAGE分离。

标记品和其它待测抗生素与膜蛋白的竞争性结合反应参照Curltis等c7，的方法进行。待测抗生素头抱唾肪与Micillinam分别与膜蛋自在30℃反应10分钟后加入一经氨节青霉素，以后的过程与上述一致。

　　三、凝胶处理和放射自显影:

　　将电泳后的凝胶立即进行固定、染色和脱色处理，用凝胶干燥器进行真空干燥。干燥后的凝胶与x光片紧密接触后在一70℃条件下曝光5-7天。

　　实验结果

　　一、标记品的鉴定:

　　我们对标记品用薄层层析法进行分析，如Fig.1所示。结果显示: 氢氨节青霉素与非标记经氨节青霉素的移动位置一致，游离的不超过10%。经以后的结合实验证实，在此标记条件下尽内酞胺环是稳定的。

　　二、结合实验:

　　用Sarkosyl一可溶部分(内膜)、Sarkosyl一不溶部分(外膜)和整个细胞外被电泳后进行放射自显影观察。结果显示，经氨节青霉素与内膜和整个细胞外被的青霉素结合蛋白的结合情况一致，其放射自显影带的位置符合报道的青霉素结合蛋白的分子量(用标准分子量蛋白做对照)，如Fig.2。标记品与外膜反应后未出现任何自显影带，说明细菌外膜无青霉素结合蛋白存在。

　　用头抱唾肘和Mieillinam分别与一经氨节青霉素、细菌内膜蛋白进行竞争性结合实验，结果见Fig.3。从中可见，头抱喷厉的特异靶位是PBP:，而Micillinam的特异靶位是PBP3，与文献报道的结果相符（8）。

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放射性碘标记羟氨苄青霉素用于青霉素结合蛋白的研究

　　讨论

　　由于青霉素G与所有青霉素结合蛋白都具有良好的结合，所以，目前大家都采用其标记物作为研究工具。，4C一PenieillinG(PCG)是目前应用最为广泛的标记品，但此标记品的比放低(1.45~2.22火10一SBq/mol)，这就造成了标记品用量大且曝光时间太长，既使在使用荧光闪烁法(Flurograp-hy)、预曝光(Prefog义ing)和超低温(一700C)条件下曝光等这些快速自显影方法，仍需要20一，60天（9-11）。采用氛标记法提高比放，由于庄内酞胺环的不稳定性，幅射　　自分解快，所以不能作为商品出售。现在必须进口，价格昂贵。

　　用标记多肤类激素和蛋白质已有大量的资料报道，但用于标记冬内酞胺类抗生素的却很少。由于许多压内酞胺类抗生素具有类似酪氨酸残基的结构成分对位经基使苯环上的氢原子活跃易被取代(如经氨节青霉素)，使放射性碘标记能够进行。而青霉素G苯环的结构特性则不适用于放射性碘标记。

　　我们制备的一经氨节青霉素，由于其比放射性高(约Bq/mol)，即使不使用荧光闪烁法和预曝光，自显影亦缩至1周左右，大大加快了整个实验周期。整个标记过程简便易行，重复性好，标记完后不需要特殊分离手段(电泳过程中自动分离)。更为重要的是解决了标记品的供给，为整个实验节约大量经费，并为其研究在国内提供了一个新的技术方法。

参考文献

（1）Spratt BG et ale Eur J Biochem 1977. 72; 341-352

（2〕Hedge PJ et al, Nature 1985, 318: 478-480

（3）Tuomanen E et aI: Antimicrob Agents Chemother 1986; 30: 659-661

（4〕Waxman DJ et al: Annu Rev Biochem 1983：52：825-829

（5〕雷雨等:《中国抗生素杂志》1388;13(5):321-325

（6〕Masson JM et al： Anal Biochem1983 128: 164-168

（7）Curbs NA et aI; Antimicrob Agents Chemother 1979, 16, 533-539

〔8〕Georgopapadakou APents Chemother NH et al, Antimicrob1980. 18. 834-836

（9）雷幼导:放射自显影的进展(待发表)

（10）Bonner WM et al; Eur J Biochem 1974: 46: 83-88

（11）Laskey RA. et ale Eur J Biochem 1975: 56: 335-341