青霉素结合蛋白与细菌对-内酰胺抗生素的抗药性机理

时间：2022-12-20 05:45:30 药学毕业论文我要投稿

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　　【论文关键词】青霉素结合蛋白　金黄色葡萄球菌　绿脓杆菌; 细菌细胞壁　病原菌　点结合　大肠杆菌

　　【论文摘要】β-内酰胺抗生素(如青霉素类和头孢菌素类等)可以专一性与细菌细胞膜上的靶位点结合,干扰细胞壁肽聚糖合成而导致细胞死亡。由于靶位点能与同位素标记的青霉素G进行共价结合,因此将这些靶位点称之为青霉素结合蛋白(Penicillin binding pro-teins,PBP’s)。一些革蓝氏阴性细菌和少数革蓝氏阳性菌能够产生多种β-内酰胺酶,这些酶可以水解青霉素和头孢菌素等抗生素,而使细胞具有抵抗这类β-内酰胺抗生素的杀伤能力。已经证明β-内酰胺酶产生与质粒和染色体基因有关。对于不产生β-内酰胺

　　β-内酸胺抗生素(如青霉素类和头抱菌素类等)可以专一性与细菌细胞膜上的靶位点结合，干扰细胞壁肤聚糖合成而导致细胞死亡。由于靶位点能与同位素标记的青霉素G进行共价结合，因此将这些靶位点称之为青霉素结合蛋白(penieillinbindsng pro-teins，PBP’s)。一些革蓝氏阴性细菌和少数革蓝氏阳性菌能够产生多种β一内酞胺酶，这些酶可以水解青霉素和头抱菌素等抗生素，而使细胞具有抵抗这类β一内酞胺抗生素的杀伤能力。已经证明β一内酞胺酶产生与质粒和染色体基因有关。对于不产生庄内酞胺酶的细菌而言，获得刀一内酞胺抗性的能力是通过改变抗生素作用的靶位点，其结果或者减少PBP’5的数量或者降低PBP‘s对物的亲和力。这种不依赖刀一内酞胺酶而存在的庄内酞胺抗性广泛存在于人类病原菌中，而绝大多数这类病原菌是从经过刀一内酞胺药物治疗过的病人中分离出来的，如许多分离到的绿脓杆菌〔1〕、金黄色葡萄球菌〔2-3〕、流感嗜血杆菌(4-5)、肺炎链球菌(6-7)、淋球菌临(8-9)、屎链球菌(10-11)等均具有内在的β-内酚胺抗性。由于临床上越来越多地分离到月耐药性细菌，对于β一内酞胺抗生素的:使用目困.提出了挑战，有关细菌对β一内酞胺药物抗性机理的研究也就越来越多地引起人们的重视，这种研究对发展新一代抗生素更有效地用于临床治疗具有重要意义。本文主要介绍细菌内在的口一内酞胺抗性机理研究进展。

　　一、PBp’S的生物学特性

　　早在1940年Gardner在观察青霉素G对敏感细菌作用时发现细胞壁是β-内酞胺抗生素最初攻击的靶位点，因为青霉素G的作用首先是削弱细胞壁的功能。后来进一步证实庄内酸胺抗生素首先与细胞膜上的PBP产S结合，这些PBP’s具有酶活性，参与细菌细胞壁肤聚糖的合成。肤聚糖主要负责维持细菌细胞壁的完整性，生长在低渗中的细菌如该结构破坏会导致细胞死亡。β一内酞胺抗生素与PBP’S结合，干扰了PBP’s的正常酶功能，使细胞壁正常合成阻断。所有检测的真细菌种至少含有3种PBP’S，有些含有8一9种。有关PBP侣的命名后面将要介绍。对大肠杆菌的PBP尹S研究得最清楚(12.13.14)。在大肠杆菌中有7种PBP’S，依次为PBPIA、IB产S、2、3、4、5、6。这7个PBP’S分别受控于10个不同的染色体遗传位点。ponA或mrcA决定PBPIA;ponB或mreB控制IB’S;pbpA或mrdA与

　　PBP2产生有关;pbpB或ftsl编码PBPs;dacB、dacA、dacC三个遗传位点分别控制PBP4、5、6。PBPIA分子量92KDa，PBPIB’C由一系列分子量在90KDa范围的蛋白质组成。PBPIA和IB p在体外兼具有转葡糖基酶和转肤基酶活性，这二种酶在细菌细胞壁合成中起重要作用，如果PBPIA和IB;S同时失活则导致细胞快速裂解死亡。PBP2分子量为66KDa，在间隔区(septa)细胞壁合成时具有转肤基酶活性，PBPZ失活，细胞变成球形体不生长。PBP3的分子量为60KDa，在IBgl隔区横壁(eross一wall)合成时有转葡糖基酶或(和)转肤基酶活性。PBP3突变细胞变成无隔膜的丝状体。PBP4分子量49KDa，具有次级的转肤基酶、D、D一竣肤酶或D、D一内肤酶活性，在肤聚糖成熟中起作用。PBP4变性导致细胞不能持续转肤作用。PBPS和6均具有D、D一狡肤酶活性，目前尚未观察到对于这二个蛋白质变性引起的细菌生理生化反应。除上述发现的7种PBP’S外，用碘代青霉素衍生物又检测到一种新的PBP’s，命名为PBPIC，有关大肠杆菌PBPIC的特点及功能还不清楚(15)。

　　同时抑制PBP工A与任何一种PBP]B’S，PBPZ或PBP3均导致生长的大肠杆菌细胞死亡。所有这些高分子量PBP’S均具有体外转肤基酶活性，除PBP2外，其它均具有转葡糖基酶活性，很明显，所有这些PBP’s在大肠杆菌细胞壁或横壁合成的催化控制中起重要作用，它们是独立的刀一内酞胺抗生素杀伤靶位点。

　　二、pBP’S分离及纯化

　　每个大肠杆菌细胞约含105~104个PBP’S分子，共分成二类，一类为含量丰富的低分子量PBP/s，具有D、D一拨肤酶活性，由于含量丰富，这类PBP’s很容易纯化。第二类由一些含量较少的高分子量PBP’S组成，纯化比较困难，而且纯化的PBP’s在体外常常检测不到酶活性。

　　早期用〔)青霉素标记敏感细菌时发现，青霉素与细胞膜上少数高亲和力PBP’s形成的复合物在2%SDS、酚水溶液或沸水中可以保持稳定，而且既便有过剩的非标记β一内酞胺药物存在时也不与标记的青霉素发生取代。PBP’s能与青霉素衍生物进行共价结合的特性使得人们能用亲和层析方法分离纯化这些蛋白质，洗脱剂用经胺，因为经胺是转肤基作用的受体，用这种方法可以纯化活性pBP’S

　　Spratt和Pardee(16)发明一种简单可重复性技术用于PBP’s分离。首先用〔〕一青霉素标记膜制备物，并使之饱和，然后用离子去污剂使之变性(主要防止青霉素一PBP复合物被酶水解)。用SDS聚丙烯酷胺凝胶电泳分离各PBP产s，根据分子量的递减或者在SDS一中泳动速率递增命名为，PBPI、2…n。各种细菌的PBP’s均用此法命名，亚类可用A、B、C等。如PBPI又分为PBP一A、1B和1C。

　　在膜制备过程中有必要保留PBP’s活性。需要说明的是，其它的β一内酞胺抗生素如甲氧西林(methieillim)、头抱西丁(Cef-oxitin)、氨苇青霉素以及moxalaetan等也可与膜蛋白结合，但所有的β一内酸胺抗生素的靶位点均位于PBP/s之间，尚未发现一种只与上述抗生素结合而不与青霉素结合的膜蛋白。另外实验表明，在分离PBP’s时，用〔〕一青霉素进行体外标记比〔〕升青霉素专一性更高。

　　三、革蓝氏阳性细菌PBP‘S改变与细菌内在β一内酞胺抗性关系

　　一般讲，革蓝氏阳性细菌细胞壁可自由透过β一内酞胺抗生素，除产生β一内酞胺酶菌株，革蓝氏阳性菌一般对青霉素敏感。目前产生β一内酞胺酶的菌株在革蓝氏阳性菌中主要是葡萄球菌，几乎所有的金黄色葡萄球菌都产生β一内酞胺酶。由于葡萄球菌产生β-内酞胺酶，临床上曾采用甲氧西林取代青霉素，但使用不久就分离到抗甲氧西林的突变株。从英国、美国、意大利、澳大利亚、日本等国分离到的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌突变株均发现含有一个共同的但在正常敏感菌株中不存在的PBP，命名为PBP2’ (或PBP2a)(17)，分子量约7sKD。，该蛋白质对广谱房内酞胺抗生素均具有较低的亲和力。该PBPZ‘在SDS一page中位于野生型PBPZ和3之间。

[1]

　　Brown和Reyoolds(18)研究表明，金黄色葡萄球菌表达甲氧西林抗性受生长条件的影响。在较低温度(30℃)或高渗透压培养基中抗性增加，在低pH值培养基中抗性降低。菌株13136p一m+在30℃对所有的庄内酞胺抗生素均有抗性，但在40℃则表现正常的敏感型。在30℃培养时，细胞膜中出现大量的PBP2’，而40℃生长的细胞则缺少这种PBP2’。因此，Brown提出，当其它的FBP’s失活后，这种新的低亲和力PBP取代了其它PBP’s的功能。PBF2’存在于所有的已检测的抗甲氧西林菌株中。除在葡萄球菌中观察到PBP’s改变外，在其它抗性菌株中也发现，如抗邻氯青霉素(Cloxacillin)枯草芽抱杆菌，相应的PBP2a对该种抗生素的亲和力降低。在分离到的青霉素抗性产气英膜梭菌突变株则降低PBPI对青霉素的亲和力。因此，在不同的革蓝氏阳性菌中，β一内酞胺抗生素与不同的PBP’s亲和力也不同。而有些细菌表达这种内在的β一内酸胺抗性机理要复杂得多。例如肺炎链球菌，该菌不产生庄内酸胺酶。用SDS聚丙烯酸胺凝胶电泳分离肺炎球菌PBP’s时发现敏感型肺炎球菌有5种青霉素结合蛋白PBPla、lb、2a、2b和3。用同样方法检测耐青霉素菌株的PBP产s发现相应的PBP’s的生化特性和对青霉素的亲和力均有所改变。耐青霉素菌株的PBPla和1b完全丧失与青霉素的亲和力，出现一种新的分子量较小的PBPlc。另外耐菌株的2b也被一种新的分子量接近于2a的PBP2a产所代替。为进一步研究PBP’s与抗药性之间的关系。Zighelboim等〔田分离野生型耐青霉素肺炎球菌8249DNA转化敏感型肺炎球菌受体菌R6。经多次转化获得一系列耐药水平不同的转化子，转化结果说明，菌株8249的高耐药(对青霉素)特征不能通过一次转化传给R6。而需要进行多次转化才能使R。逐渐获得较高的抗性性状。Shoekley等〔20〕以及其它的研究者对肺炎球菌耐药机理研究也得出相同的结果。目前对于肺炎球菌有多少遗传因子与抗药性有关还不清楚，但多重转化实验逐步获得高水平耐药性转化子说明野生型菌株8249携带有多重突变的遗传因子，抗药性是受多基因控制，那么受体菌需要吸收多个DNA分子以满足细胞获得高水平抗性的需要。这种需要多次转化逐步获得较高的抗性水平的现象在金黄色葡萄球菌中也得到证实(17)。

　　从上述研究不难看出，在革蓝氏阳性细菌抗性菌株中新出现的低亲和力PBP’s阻止了β内酞胺抗生素对细胞的抑制作用，当其它的PBP’s由于抗生素结合而失去活性时，这些低亲和力PBPs可以补偿其它PBP’s的功能。另外，在抗性菌株中，相应的PBP’s从高抗生素亲和力向低亲和力方向改变，肺炎链球菌PBP’s改变是说明这类问题最好的例子。

　　四、革蓝氏阴性细菌PBP’s改变与细菌内在β一内耽胺抗性关系

　　革蓝氏阴性细菌的外膜穿透能力变化较大，一般在奈瑟氏菌中较高，在假单抱菌中较低，而肠道菌处于中间水平。多数革蓝氏阴性细菌产生介内酞胺酶，这些酶能水解青霉素类、头抱菌素类等类抗生素。现已发现绝大多数肠道菌、25%的流感嗜血杆菌、拟杆菌、假单胞菌、淋球菌、粘膜炎布兰汉氏球菌均产生庄内酞胺酶。

　　对不产生β-内酞胺酶但具有青霉素抗性的淋球菌分析表明，有6个遗传位点PenA、mtr、penB、peln、tem、env控制菌株内在的庄内酞胺抗性〔20，“‘’。penA基因专一性决定低水平青霉素抗性，mtl~基因本身除增加对青霉素抗性外还与其它的抗生素抗性有关，tem和pen基因本身没有可表达的性状，但转化实验证明，这二个基因携同其它三个基因一道可以提高菌株对青霉素的抗性，env基因突变则削弱青霉素抗性表达。

　　Dougherty等发现，青霉素抗性淋球菌首先降低PBPZ对青霉素的亲和力，然后降低PBPI的亲和力，降低PBPI的亲和力可使菌株获得较高水平的青霉素抗性，当然这一作用同时受其它基因位点的调节。penA与降低PBP2的亲和力有关。

　　从临床接受呱拉西林(piperaeillin)治疗的患者体内分离到的β一内酞胺抗性M型和K型绿脓杆菌，发现PBP’s改变可以增加菌株对户内酞胺抗性水平。在低水平抗性K型绿脓杆菌中，PBP3或者缺少，或者丧失对青霉素的结合能力。中等水平抗性的M型绿脓杆菌菌株则降低所有的PBPs对青霉素的结合能力。另外，从一起淋球菌暴发流行中分离到带有penA、mtr、penB以及tet基因突变的菌株，这些菌株除改变相应的PBP’s对青霉素的亲和力外，还缺少一种正常的外膜蛋白(22)。

　　对三株具有内在庄内酸胺抗性但不产生β-内酞胺酶的流感嗜血杆菌分析指出，这些抗性菌株的抗药性是由多重因子决定的，而且细胞通透性改变同时引起外膜蛋白改变，并降低PBP3、6或3、4或4对青霉素的亲和力。

[2]

　　在某些革蓝氏阴性细菌中，改变一种或多种PBPs兼有影响抗生素穿透外膜的功能。已知在革蓝氏阴性细菌中β一内酞胺抗生素进入细胞是通过专一性的porin通道，在大肠杆菌突变株研究中证明，外膜蛋白。nZpC和ompF缺陷会导致菌株的低水平户内酞胺抗性(24-25)。细菌对于β一内酞胺抗生素的内在抗性机理主要通过细菌细胞的物作用点发生改变，降低或失去抗生素与作用点的结合能力，干扰或阻断药物进入细菌细胞。在细菌中广泛存在着PBP‘s改变导致细菌内在的β一内酸胺抗性现象可以使人们分离纯化这些PBPs，研究其生理生化特性及构象改变与抗性的关系，创造新一代能够与这些改变的PBP’s有效结合的β一内酞胺抗生素类。同时也可以改造现有的抗生素，或采用户内酞胺抗生素的混合物攻击不同的PBP’s以达到杀伤细菌的目的。对于那些产生β一内酞胺酶的细菌而言，将庄内酸胺抗生素与庄内酞胺酶抑制剂棍合使用也是解决细菌庄内酞胺抗性问题的一种途径。

　　为达到有效地杀伤病原菌，一定要控制滥用抗生素的现象，另外根据不同地区病原微生物流行特点使用不同的治疗途径是十分必要的。

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