发酵黄芪对BALB/C小鼠免疫功能及细胞因子的作用

时间:2020-08-06 10:51:57 药学毕业论文 我要投稿

发酵黄芪对BALB/C小鼠免疫功能及细胞因子的作用

     【摘要】  目的研究发酵黄芪对小鼠免疫功能及细胞因子的影响。方法将小鼠随机分成正常对照组、免疫抑制组、黄芪对照组和发酵黄芪低、中、高3个剂量组(剂量分别为 1,2, 5 g/kg),饮水法喂饲小鼠,分别检测以下指标: 小鼠胸腺和脾脏指数,淋巴细胞亚群,淋巴细胞增殖功能,腹腔巨噬细胞吞噬功能、IL-1、IL-2分泌。结果与免疫抑制对照组比较,发酵黄芪高、中剂量能显著促进淋巴细胞的转化,使CD3、CD4 、CD4/CD8明显上调,促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力,促进白介素-1(IL-1)和白介素-2(IL-2)的产生(P均<0.05)。结论发酵黄芪能提高机体的免疫功能,其作用机制与激活T细胞、T淋巴细胞亚群、巨噬细胞功能及促进细胞因子分泌有关。

     【关键词】  发酵黄芪; 免疫功能; 细胞因子; 小鼠

     黄芪作为常用的补益类中药,具有补气固表及健脾利肺的功效。目前国内外现代研究也已证实,黄芪含有多糖、苷类、生物碱、黄酮、微量元素及其氨基酸等成分具有调节机体免疫功能的作用[1,2]。为了进一步开发传统的中药剂型,研究发酵黄芪对小鼠免疫系统及功能的作用,对传统中药的二次开发提供理论及应用的可行性依据。

  1 材料与仪器

  1.1 动物及细胞株健康BALB/C小鼠,雌雄各半7~8周龄,体质量18 ~22 g,由河北医科大学实验动物中心提供;C57BL/6,雌性体质量18~20 g,一级动物,合格证号:冀医动字第04035号。

  1.2 药品与试剂发酵黄芪由保定生物公司提供。RPMI-1640培养基、小牛血清:美国GIBCO公司;胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)、刀豆蛋白(ConA)为Sigma公司产品。 抗Thy1、2;抗LST4、抗 Lyt2美国FLUKA公司;环磷酰胺,上海第二制药厂制造,(CycloPhosPhamide, CP)。二甲基亚砜(DMSO)购于上海化学试剂公司,其余试剂均为分析纯。

  1.3 仪器倒置显微镜(PM-10AD),OLYMOUS日本。二氧化碳孵箱(TC2323,美国SHEL.LAB公司);酶标仪(奥地利公司)。流式细胞仪,美国(FACS-420)。

  2 方法

  2.1 动物分组处理与给药BALB/C小鼠随机分成6组,每组7只动物,分别为生理盐水对照组、环磷酰胺组、黄芪对照组、发酵黄芪小剂量组(1 g/kg)、中剂量组(2 g/kg)和高剂量组(5 g/kg)。黄芪组(1 g/kg)每天每只灌服0.5 ml,对照组灌服等量生理盐水。环磷酰胺组ip给药连续3 d造模。第8天各组颈椎脱臼处死小鼠,无菌取胸腺、脾测定。

  2.2 脏器/体重比值测定实验结束,称质量、胸腺重、脾重,取小鼠脾脏和胸腺称重(湿重),计算脏器指数(%)=脏器重量(g)/动物质量(g)×100%。

  2.3 小鼠脾细胞悬液的制备及脾淋巴细胞活力的检测采用MTT法[3] 小鼠分组与喂饲方法同上。 无菌取脾,经过研磨200目细胞筛网过滤、经常规裂解红细胞,hank's液洗涤,离心2次,制得单细胞悬液,最后用含10%小牛血清RPMI-1640调细胞浓度5×106个/ml,接种于96孔板(100 μl/孔),每组6个平行孔,每孔100 μl。37℃保湿培养68 h后,每孔加MTT 10 μl,继续培养4 h后,每孔加入DMSO 150 μl,振荡5 min,紫色结晶完全溶解后于酶标仪570 nm测定A值。

  2.4 小鼠脾细胞亚群测定(流式细胞仪)[4]将6~8周龄、体质量(20±2) g BALB/C雌性小鼠随机分成6组,每组6只。无菌取小鼠胸腺细胞,4%甲醛固定,预冷PBS清洗,加入荧光标记的CD3、CD4、CD8单克隆抗体50 μl,37 ℃ 30 min, 1 000 r/min离心10 min,加入荧光标记的二抗工作液50 μl,37 ℃ 30 min,RNase消化,1ml碘化丙,每份样本平均测定1×104个,分析相应阳性细胞的含量。

  2.5 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定[5] 小鼠分组与喂饲方法同上。按常规制备小鼠腹腔巨噬细胞,置24孔培养板每孔加细胞悬液1 ml,5% CO2,37 ℃ 培养2 h,去上清液,用RPMI 1640培养液洗去未贴壁细胞,每孔加入0.1%中性红生理盐水液1ml,5% CO2,37℃培养2 h后,甩弃中性红,并用预温的BPS清洗未吸收的中性红,吸水纸吸干,每孔加入细胞裂解液1 ml,静置4 ℃ 过夜,用蒸馏水调零,