谈基因定位技术在遗传病诊断中的应用
摘要： 荧光PCR定量技术(Quantitative PCR)是一种新兴的基因定位技术。这项技术灵敏、简便、快速、不需使用放射性同位素，PCR完成后，通过测序仪的自动识别即可对待测DNA进行定量分析。在遗传病，特别是一些以大片段缺失为主要突变类型的遗传病诊断中，荧光PCR定量技术发挥了很重要的作用。关键词：荧光PCR定量技术；基因定位技术；遗传病
在早期的遗传学分子诊断中，主要依赖于Southern Blotting，寡核苷酸杂交等技术。自1985年Saiki等首次描述聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)以来，PCR技术因为其灵敏特异，省时省力等诸多优点而受到了人们的高度重视，已经应用于生物医学和化学等基础研究的各个领域，并且成为医学临床和法医学研究的强有力分析工具之一[1-3]。然而，近几年来，研究者们不再满足于得知某一特异DNA序列的存在与否，他们更着眼于对其进行精确的核酸定量。尽管把PCR作为一种定量的工具，在技术上还面临着一些挑战。荧光PCR基因定位技术是近十余年来兴起的一种分子生物学技术，与其他定量方法相比，具有灵敏、简便、快速、不需使用放射性同
位素的特点，在基因表达、传染病和遗传病的诊断等方面迅速得到了广泛应用。
1 荧光PCR基因定位技术的原理
荧光PCR定量技术的主要原理为：在PCR前，通过化学方法在引物的5’端通过共价方式连接一个荧光分子。由于在进行PCR时，引物和待扩增模板5’端的碱基不需要完全匹配，荧光PCR引物和普通PCR引物一样，能够对待测模板进行指数扩增。扩增完成后，根据PCR的产量，将荧光PCR产物直接或按一定比例稀释后，和内标、载样缓冲液混合，在自动测序仪上进行电泳。在自动测序仪内激光的激发下，PCR产物上的荧光分子发出固定波长的激发光，被仪器内的光电管捕获。根据PCR产物从开始电泳到经过光电管的时间，测序仪自动计算出相应产物的实际碱基数。不同泳道之间电泳速度的差别，通过各产物内混合的内标校正。同时，测序仪也自动标出相应产物的荧光强度，该数值就是荧光PCR定量技术对模板进行定量与定位的基础。与非定量PCR分析方法不同，荧光PCR的操作程序有助于评估污染的情况，即测出污染的程度，即使阴性对照产生了正的信号，只要这些信号比实验样品的低得多，依据这样的结果，至少可以推测出实验中所得出的信号是真实的[4-6]。在一定程度上，荧光PCR消除了普通PCR过于敏感、假阳性率高的缺点。荧光PCR常用于研究发病机制、估计病毒的负荷量、监测临床治疗进展或用于诊断遗传缺陷等。通过对靶基因量的检测，将其与疾病的临床表现、临床分型以及各种标志酶的值联系起来，为疾病的诊断和药物治疗监测提供科学的依据。目前，该技术已广泛应用于多种遗传病的诊断和产前筛查，如地中海贫血、儿童型脊肌萎缩症、杜氏/贝氏肌营养不良、胖骨肌萎缩症和各种染色体病等。
2 荧光PCR基因定位技术在遗传病诊断中的应用
2.1 在α地中海贫血中的诊断作用
1988年，Chehab用两对引物同时扩增α珠蛋白和β珠蛋白基因，并在这两对引物上分别标记上罗丹明和荧光素。在紫外线的照射下，罗丹明产生红色荧光而荧光素产生绿色荧光。在同一循环条件下PCR完成后，通过离心将扩增产物和游离引物分离，根据扩增后产物颜色直接判断基因的缺失情况[7]。如产物为桔红色，则说明α和β珠蛋白基因都得了扩增。如果产物为绿色，说明α珠蛋白基因缺失，只有显绿色荧光的β珠蛋白基因得到了扩增。
2.2 在DMD/BMD中的应用
DMD/BMD(杜氏/贝氏肌营养不良症)是最常见的'致死性神经肌肉遗传病。在男性中，其患病率约为1/3 500，为x连锁隐性遗传，其中73%为缺失或重复突变，新生突变占所有患者的30%。由于x染色体的随机失活比例不同，约40%的DMD携带者不能通过血清CPKH活性诊断。1992年，schwartz将荧光PCR应用于该病的携带者诊断。他们采用荧光引物和测序仪分析位于肌营养不良基因内部的4对CA重复序列。测序仪可以鉴别2个碱基对长度的差异，能够为连锁分析提供更多的信息[8]。在以下情况时，连锁分析有时不足以对携带者进行判断：①CA重复不能提供信息，②家族成员不全，③新生突变或者嵌合体造成的连锁分析失效，因此，他们还采用荧光PCR直接扩增肌营养不良基因外显子，并用测序仪定量分析产物，将结果和连锁分析一起作为判断携带者的依据。通过以上方法，他们对43名可疑携带者进行了诊断。