NK-104对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3活性的影响

NK-104对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3活性的影响

【摘要】 研究日本新近研制的第三代3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA， HMG-CoA）还原酶抑制剂匹伐他汀（pitavastatin， NK-104）对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影响。方法:采用细胞培养技术，以肝癌细胞系HepG 2为靶细胞，以不同浓度的药物处理细胞48 h后，利用WST-8法测定NK-104对细胞增殖的影响;利用荧光染料Hoechst 33258染色，荧光显微镜观察细胞核碎片;以流式细胞仪分析细胞周期的变化;采用半胱氨酸蛋白酶3比色法检测caspase-3活性。结果:NK-104（10 μmol/L）对HepG 2细胞有明显抑制作用，可诱导HepG 2细胞凋亡，并能增强caspase-3基因的活性。结论:NK-104能够诱导HepG 2细胞凋亡，其机制与caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关。
【关键词】 肝癌
　3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA， HMG-CoA）还原酶抑制剂，统称为抑制素，是重要的脂类合成抑制剂，主要在人体肝脏中代谢，临床上广泛应用于治疗高脂血症［1］。 最近研究发现，HMG-CoA还原酶抑制剂具有生物学多效性，与降血脂无关。有报道其在体外具有抗癌作用［2］、体内与5氟尿嘧啶（fluorouracil， 5-Fu）共同作用能够延长晚期肝癌患者的生存期［3］。匹伐他汀（pitavastatin， NK-104）是日本新近研制的第三代高效HMG-CoA还原酶抑制剂［4］。在血管内皮细胞系NK-104通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B， PI3K-Akt）基因激活途径对内皮细胞的保护作用已有报道［5］，但其在肝癌细胞系的抗癌作用尚未见报道。本文在肝癌细胞系HepG 2通过2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2，4-二硫代苯）-2H-四氮唑单钠盐 ｛［2-（2-methoxy-4-nitrophe-nyl）-3-（4-nitrophenyl）-5-（2，4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium， monosodium salt］， WST-8｝、荧光染料Hoechst33258染色、流式细胞仪和半胱氨酸蛋白酶3比色法等检测方法，研究NK-104对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影响，为NK-104在抗肿瘤中的作用机制提供实验依据。
　　1 材料和方法
　　1.1 主要材料与仪器 NK-104，日本兴和有限公司（日本名古屋）和日产化学工业公司（日本东京）产品;荧光染料Hoechst 33258、甲羟戊酸（ mevalonic acid， MEV）和碘化丙啶（propidium iodide， PI）染色液（PI 100 g/L， 1% Triton 100， 9 g/L NaCl），Sigma公司产品。流式细胞仪，2000 FCA，美国BD公司产品。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 细胞培养 人肝癌细胞株HepG 2（美国ATCC公司产品）在含10%胎牛血清的DMEM培养基、5% CO2、37 ℃条件下培养。实验中，细胞种植于适当培养皿中，90%的细胞融合时，用磷酸盐缓冲液洗净后，加入适量含有NK-104和MEV（ 1 mmol/L ）等药物的培养液，37 ℃培养箱中培养。
　　1.2.2 WST-8方法 利用WST-8试剂盒对细胞增殖进行测定。HepG 2细胞（1×104个细胞/孔）接种于含100 μl培养液的96孔培养板中，NK-104（ 0.1 ～100 μmol/L）治疗48 h后，分别加入WST-8试剂10 μl（日本同仁化学研究所）培养2 h后，选择450 nm波长，测定各孔的吸光度OD值。
　　1.2.3 Hoechst 33258染色 细胞经药物刺激 48 h 后，甲醇-冰乙酸（3∶1）细胞固定液4 ℃固定5 min，磷酸盐缓冲液稍洗后，点加Hoechst 33258染色液， 10 min 。用滤纸沾去多余液体，封片剂封片后荧光显微镜观察细胞核碎片。
　　1.2.4 流式细胞仪检测凋亡峰 在室温下将刺激48 h后的细胞用冷磷酸盐缓冲液洗涤2次，并在适当的染色缓冲液中吸取100 μl的细胞（1×105）至试 管中。加入200 μl RNase A，37 ℃水浴30 min，再加800 μl PI染色液混匀，4 ℃避光30 min后，立即上机分析。
　　1.2.5 半胱氨酸蛋白酶3比色法 经药物治疗 48 h 后收集细胞，采用半胱氨酸蛋白酶3比色法试剂盒按照厂家说明进行测定（Medical

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