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银染PCR
作者：阎丽，肖冰，宋卫兵，耿炎，赖卓胜【关键词】 大肠癌;线粒体DNA;D
Mutation analysis of mitochondrial DNA in colorectal carcinoma tissues by silverstaining PCRSSCP
【Abstract】 AIM: To analyze the mutations of mitochondrial DNA in colorectal carcinoma tissues. METHODS: Sliverstaining Polymerase Chain ReactionSingle Strand Conformation Polymorphism (PCRSSCP) technique and sequence analysis were used to detect the point mutation changes on the Dloop region in mitochondrial DNA in 40 colorectal carcinomas together with the adjacent normal tissues. RESULTS: Among the 40 colorectal carcinomas, point mutations were found in 7 colorectal carcinoma tissues with the mutation rate of 18% （7/40）. Among the 9 point mutations, 3 point mutations were found in a colorectal carcinoma of Dukes stage D and the other 6 point mutations were found in 6 colorectal carcinomas of Dukes stage C. C to T mutation at np498 and at np16298 were found in 7 colorectal carcinomas with point mutations. CONCLUSION: A certain degree of point mutations is found in the Dloop region of mitochondrial DNA in colorectal carcinoma tissues, and the occurrence of mutations may be associated with colorectal carcinoma susceptibility and malignant grade, but whether the mutations have carcinogenicity needs further study.
【Keywords】 colorectal carcinoma; mitochondrial DNA; Dloop; mutation
【摘要】 目的： 研究大肠癌组织线粒体DNA的突变情况. 方法： 用银染PCRSSCP技术结合测序的方法检测40例大肠癌组织及其癌旁正常组织的线粒体DNA D环区的点突变情况. 结果: 40例大肠癌组织中检测到7例点突变改变，突变率为18%（7/40），在检测的9个突变位点，3个突变位点存在于Dukes D期的1例大肠癌中,其他6个突变位点分别存在于Dukes C期的6例大肠癌组织中,其中498位C→ T, 16298位C→T两个突变位点在检测到点突变的7例大肠癌组织中均检测到. 结论：大肠癌组织线粒体DNA D环区存在一定程度的点突变，突变的发生可能与大肠癌的易感性和恶性程度有一定相关性, 但是否是大肠癌的发病机制尚有待进一步研究.
【关键词】 大肠癌;线粒体DNA;D环区;突变
0引言
目前认为肿瘤的生物学特征不仅取决于核内遗传物质，与核外线粒体DNA的改变也有非常重要的关系［1-2］，国内外多项研究发现线粒体DNA的D环区可能为线粒体DNA突变的热点所在，但不同的肿瘤，有关该区突变的频率报道存在明显差异［3-4］. 为了进一步研究大肠癌组织线粒体DNA的D环区是否存在共性的突变位点，并探讨这些共性的突变位点是否与大肠癌的发生机制有一定相关性，我们用银染PCRSSCP技术结合测序的方法对40例大肠癌组织及对应的癌旁正常组织的线粒体DNA的D环区进行研究.
1材料和方法
1.1材料200310/200405，经南方医科大学南方医院手术切除证实为大肠癌患者的组织标本40（男22, 女18）例, 年龄32~75(平均53.6)岁, Dukes分期：B期6例，C期28例，D期6例. 线粒体DNA提取试剂盒购自杭州Vgene公司; 2×Pfu PCR MasterMix一管便捷式PCR扩增试剂盒购自清华大学天为时代公司；银染PCRSSCP试剂购自广州威佳生物试剂公司.
1.2方法按照线粒体DNA提取试剂盒上的步骤提取40例大肠癌及癌旁正常组织的线粒体DNA, 根据大肠癌线粒体DNA D环区的全长设计四对引物，分别为引物1: 5′GATCACAGGTCTATCACCCTATTAAC3′, 引物2: 5′GGTTTGGCAGAGATGTGTTTA3′扩增355 bp的片段，引物3：5′GCTTCTGGCCACAGCACTTA3′，引物4: 5′GCCCGTCTAAACATTTTCAG3′，扩增313 bp的片段，引物5: 5′CTTTCATGGGGAAGCAGATT3′，引物6: 5′TGTTGGT
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