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膀胱癌细胞凋亡与MDM2和P53基因表达的意义
作者：杨承纲，张丽娟，李梅，陈芸【关键词】 膀胱肿瘤；P53基因；MDM2基因；免疫组织化学；细胞凋亡
［摘 要］ 目的：研究膀胱癌细胞凋亡、MDM2、P53基因表达的意义。方法：采用免疫组织化学方法及TUNEL法检测11例“正常膀胱黏膜”和83例膀胱移行细胞癌中MDM2、P53基因的表达及细胞凋亡指数。结果：P53阳性率为50.6%,MDM2阳性率为59.03%，AI=1.433 5±0.386 3。MDM2阳性表达与病理分级及临床分期呈负相关(R=-0.263,P=0.016及R=-0.388,P=0.001);P53阳性表达与病理分级及临床分期呈正相关(R=0.492,P=0.001；R=0.341，P＜0.01);MDM2、P53三种蛋白间表达无相关性；AI与MDM2呈负相关（R=-0.226,P=0.042）；AI与病理分级及临床分期呈正相关(R=0.642,P=0.000；R=0.455，P=0.000)；AI与P53无相关性。AI、P53、MDM2的表达与5 a生存率有关。结论：联合运用临床分期及病理分级并检测P53、MDM2可用于判断膀胱移行细胞癌的预后。
［关键词］ 膀胱肿瘤；P53基因；MDM2基因；免疫组织化学；细胞凋亡
Clinical Significance of Expression of MDM2 P53 Protein and Apoptosis in Bladdercancer
Abstract：Objective To investigate the expression of MDM2 Pgp protein and apoptosis and its significance in bladder cancers.Methods Apoptosis Index(AI) was assessed with TUNEL technique,and immunohistochemical stainings of MDM2 and Pgp were performed in 83 cases of the carcinomas and 11 “normal” bladder mncosa.Results The positive expression rate of P53 gene was 50.6% and MDM2 was 59.03%,and AI=1.433 5±0.386 3.The level of MDM2 was negative correlated with the tumor pathological grade and clinical stage(R=-0.263,P=0.016及R=-0.388,P=0.001);The level of P53 was positive correlated with the tumor pathological grade(R=0.492,P=0.001);No correlated was found between MDM2 and P53 gene;The level of AI was negative correlated with MDM2(R=-0.226,P=0.042);The level of AI was positive correlated with the tumor pathological grade and clinical stage (R=0.642,P=0.000；R=0.455，P=0.000);The level of AI was no correlated with P53.AI and the expression of P53 and MDM2 were related to 5year survival rate.Conclusion By exerting the tumor pathological grade and clinical stage and detecting P53 MDM2 genes expressions,the prognosis of bladder cancer can be decided.论文网在线
Key words：Bladder neoplasm；P53 gene；MDM2 gene；Immunohistochemistry；Apoptosis
MDM2基因是一原癌基因，与P53构成降解反式激活循环通路，参与细胞生长抑制、凋亡、细胞周期调控等过程。细胞凋亡是由基因调控的细胞主动死亡过程，同肿瘤的发生发展以及临床治疗有密切的关系。本研究采用免疫组化方法观测MDM2、P53基因在人膀胱癌细胞中的表达及用TUNEL法检测细胞凋亡，探讨它们在膀胱癌的发生发展中的作用及其对膀胱癌生物学行为和预后的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 收集本院病理科1996年至2004年间膀胱移行细胞癌83例及11例正常膀胱黏膜组织，83例膀胱移行细胞癌中男性66例，女性17例，年龄35岁~82岁，平均年龄58.5岁。病理检查前均未接受过放疗和化疗，术后均进行化疗药物膀胱灌注。按1999年WHO病理组织学分级标准，Ⅰ级29例，Ⅱ级31例，Ⅲ级23例；按UICC临床分期，TisT1期61例，T2T4期22例。所有标本均经10%甲醛固定、石蜡包埋，4 μm厚连续切片。术后随访16个月~5 a，平均38个月，失访5例，肿瘤复发或转移56例，死亡2例，无复发或转移20例。
1.2 方法
1.2.1 阴性、阳性检测 MDM2、P53单抗均购自福州迈新公司。采用SP法进性免疫组化染色，严格按照试剂盒说明书操作。用已知阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。结果判定：MDM2、P53以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞＞10%为阳性结果，反之为阴性结果（见图1，图2）。
图1 P53阳性表达于肿瘤细胞核，呈棕黄色颗粒(SP×400)（略）
图2 MDM2阳性表达于细胞核呈棕黄色颗粒（SP×400）（略）
1.2.2 凋亡个数检测 细胞凋亡检测（末端脱氧核苷酸转移酶介导的xdUTP切口末端标记，terminal deoxynucleotide transferase mediated dUTPnick end labeling method,TUNEI法）试剂盒，DAB显色试剂盒购于福州迈新公司。步骤：切片脱蜡水化，3%H2O2清除内源性过氧化酶10 min，蒸馏水洗涤2 min共洗3次；加TBS1∶100蛋白酶K，37 ℃消化10 min，蒸馏水洗涤2 min共洗3次；每片加TDT和DIGdUTP各1 μl，标记缓冲液18 μl，4 ℃冰箱过夜，TBS洗2 min共洗3次；加封闭液50 μl，室温30 min；封闭液1∶100生物素化地高辛抗体50 μl，37 ℃反应30 min；TBS洗2 min共洗3次；加TBS1∶100稀释SABC，37 ℃反应30 min；TBS洗5 min共洗4次；DAB显色，苏木素衬染，脱水、透明、封片。实验中以不含TDT的试剂作阴性对照。结果判定：TUNEL法检测阳性表现为在肿瘤组织中散在分布胞核呈棕黄色颗粒着色的细胞(见图3)。在400倍光镜下，随机选择10个视野并计数1 000个肿瘤细胞，记录凋亡细胞数。计算细胞凋亡指数（AI），AI=（凋亡细胞数/1 000）×100%［1］。
图3 细胞凋亡阳性表现为肿瘤细胞核呈棕黄色颗粒（×400）（略）
1.3 统计方法 实验数据经SPSS统计软件包处理，数据以±s表示，采用t检验，方差分析，相关分析，cox多因数分析，以P＜0.05作为差异有显著意义的检验标准。
2 结果
2.1 检查 83例膀胱移行细胞癌中,有42例(50.6%) P53阳性,49例(59.03%) MDM2阳性，AI=1.433 5±0.386 3。
2.2 病理分级及临床分期中比较 MDM2Ⅰ级、Ⅱ级与Ⅲ级间表达差异有显著性(P＜0.05)，Ⅰ级与Ⅱ级间表达差异无显著性(P＞0.05)；P53Ⅰ级与Ⅱ、Ⅲ级间表达差异有显著性(P＜0.05)，Ⅱ级、Ⅲ级间表达差异无显著性(P＞0.05)。MDM2在TaT1与T2T4间表达差异有显著性(P＜0.05）,P53在两组中表达差异无显著性(P＞0.05)。AI在Ⅰ级、Ⅱ级与Ⅲ级间表达及TaT1与T2T4间表达差异有显著性(P＜0.01)。相关分析发现,MDM2阳性表达与病理分级及临床分期呈负相关(R=-0.263,P=0.016；R=-0.388,P=0.001);P53阳性表达与病理分级及临床分期呈正相关(R=0.492,P=0.001；R=0.341，P=0.002);MDM2、P53两种蛋白间表达无相关性；AI与MDM2呈负相关（R=-0.226,P=0.042）；AI与病理分级及临床分期呈正相关(R=0.642,P=0.000；R=0.455，P=0.000)；AI与P53无相关性。5 a随访AI及P53复发死亡组显著高于无复发组；MDM2复发死亡组显著低于无复发组。详见表1。
2.3 MDM2基因在P53基因阳性表达在膀胱癌中的表达 分析发现P53阳性表达合并MDM2阳性表达多见于分化好的膀胱癌Ⅰ级、Ⅱ级与Ⅲ级间表达差异有显著性(P＜0.05详见表2。
表1 Pgp、MDM2、P53表达与病理分级及临床分期的关系（略）
注：*P＜0.05**P＜0.01
表2 MDM2基因在P53基因阳性表达膀胱癌中的表达（略）
注：*P＜0.05
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