浅析非病毒载体基因转移技术的现状和展望

浅析非病毒载体基因转移技术的现状和展望

摘要：目前基因治疗已经成为科学家治疗多种难治性疾病的一种新手段，基因导入技术是基因治疗的核心也是最基本的技术。目前研究较多的基因导入技术共分为两大类：一，病毒载体基因导入法；二，非病毒载体基因导入法。前者转染效率高,但存在安全性和免疫原性等问题。因此,近年来人们对非病毒类载体系统给予了更多的关注。

关键词： 非病毒载体 基因转移技术 现状和展望

非病毒载体基因转移方法又分为物理方法和化学方法。物理方法如：注射法、基因枪法、电穿孔法、超声波法等都是借助物理力量穿透细胞膜达到基因转移的目的；化学方法则是借助天然的或者人工合成的化合物辅助完成基因转移。尽管近年来在非病毒基因转移领域中取得了显著成效，但总体而言，非病毒载体相对于病毒载体来说转移基因的效率要低，在体内的基因转移尤其如此。现在把目前较常用的非病毒载体基因转移方法的优势和局限综述如下。
1 物理方法
就是基于物理力量造成细胞膜的瞬间缺损，从而使质粒DNA进入细胞内的方法。如基因枪法、电穿孔法、超声波法等，还有近年来发现的激光相关辅助方法。
1.1 注射法
直接将质粒DNA注射入组织细胞中达到基因转移的目的。有学者成功地将裸露的质粒DNA注射入肌肉、肝脏[1]、皮肤[2]等组织，但基因表达水平较低。注射法中，细胞表面的某些受体起了一定的作用，它们能够特异或者非特异性地结合DNA并且介导DNA的内吞，但这些受体的详细作用机制不甚清楚。由于注射法有其独特优点如：方法简单，不需特殊试剂且毒性低而受到欢迎。此外，借助显微操作系统进行的显微注射法是目前国际上公认的制备转基因和基因剔除动物模型的首选。
1.2 基因枪法
基因枪法是一种全新的基因导入技术，它以压缩气体（氦或氮）转换成的气体冲击波为动力，把附着于高速微弹上的DNA直接射入细胞、组织和细胞器，基因枪导入的基因被证明可在广泛类型的细胞中得到瞬时的、高效率的表达。基因枪法是皮肤、黏膜以及手术局部暴露组织较理想的基因转移方法，因而基因枪被认为是将来DNA疫苗的良好免疫工具。但是基因枪法用于基因治疗还需要进一步改进，如通过对微弹颗粒表面结构的改良使其可以结合更多的DNA或者使结合更紧密；通过对气体冲击波压力的调节来调控微弹的运动轨迹等。
1.3 电穿孔法
通过短暂的高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而将周围介质中的外源核酸分子导入细胞内。电穿孔法是一种既可以用于体外也可以用于体内的基因转移方法。理论上任何可以插入两个电极的组织器官都可以用电穿孔法导入外源基因，然而目前体内用电穿孔法导入基因主要用于皮肤和肌肉组织。100KD的DNA被报道可以利用电穿孔的方法成功导入肌肉组织中[3]。电穿孔导入的外源基因也有被报道长期稳定表达超过1年时间[4]。本课题组前期工作中利用电穿孔法将质粒pGFP?N2导入白血病细胞株K562中后，经过筛选培养，最终表达绿色荧光的细胞高达90％以上,稳定表达时间在半年以上[5]。该方法转移基因时，DNA的浓度以及DNA在组织中的分布对电穿孔的效率至关重要。用电穿孔法进行体内基因导入时存在如下局限：①两个电极的距离不能超过1cm，这样就很难实现大面积的细胞同时基因转移；②如果是内脏的基因导入，必须借助外科手术放置电极，损伤较大；③该法所用的电压较高，容易导致局部组织细胞被电灼伤。此外，较高电压作用于细胞后可能会影响细胞自身基因组DNA的稳定性。以上局限性有望通过对电极的优化及电场强度的调节而减少到最低。值得一提的是现在出现了类似于传统电穿孔法的细胞核转染法，借助细胞核转染仪，采用独特的电场参数与细胞类型特异性的转染溶液相结合的方法，将细胞转染效率大大的提高，而细胞的死亡率则大大的降低。转染条件对于不同的细胞不需要摸索和优化，而且绝大多数细胞被转染后4h就可以见到转染基因的表达。
1.4 超声波法
超声波在医学领域分为诊断性超声和治疗性超声。治疗性超声常用于组织深部加热、缓解局部疼痛和促进炎症吸收等。超声在一定的波长和强度下能增加血管和细胞膜的通透性，尤其有利于全身用药和转基因时药物和DNA在局部组织细胞的定位。超声波法比单纯DNA注射法的基因转移效率要高10～20倍。该法用于基因转移的效率受诸多因素影响：如超声波的频率、强度和作用时间以及所用质粒DNA的量等。此外，由于造影剂在超声波作用下变为迅速扩张和缩小的含气泡沫，从而在局部产生波动，使临近细胞膜通透性瞬间增加，所以造影剂的使用可以增加超声波的基因转移效率。与电穿孔不同，超声波作用后细胞膜出现微孔，基因通过自由扩散的方式通过微孔进入细胞，因而质粒DNA的大小及浓度对基因转移效率影响较大。超声波用于体内组织器官基因导入的优势在于其为一种无创的基因转移方法。然而到目前为止，超声波用于基因转移的主要局限在于其效率较低。
2 化学方法
目前非病毒载体基因转移方法中研究最热门的还是阳离子脂质体和阳离子聚合物介导的基因转移，携带目的基因的阳离子脂质体或聚合物通过细胞吞噬或吞饮作用进入靶细胞中，一部分目的基因将在胞浆中被释放出来并转移入细胞核发挥作用。
2.1 阳离子脂质体介导的基因转移
自从Felgner等科学家[6]于1987年首次发现脂质体具有转移基因的作用后，大量的阳离子脂质体被改良后用于基因的转移。这些脂质体主要区别在于它们所带电荷及细微结构的不同。尽管有部分脂质单独就可以形成囊泡发挥较好的基因转移作用，但很多阳离子脂质需要磷脂或者胆固醇辅助作用下才能形成脂质体囊泡。当把目的DNA与这种脂质体混合后，DNA就会浓缩并与之形成较稳定的脂质体DNA复合物(lipoplex)。由于脂质体具有类似生物膜的性质，因此当脂质体DNA复合物与细胞膜接触后，通过胞吞作用而进入胞内。如今不断改良的阳离子脂质体试剂在稳定转染、瞬时转染以及难以转染的细胞系应用中都表现出超乎寻常的效果。此外，脂质体没有免疫原性,细胞毒性小,而且也易于制备,因此阳离子脂质体已成为现今用于基因转移的最常用方法之一。
为了达到特异性基因转移的目的，科学家们相继开发了免疫脂质体和配体脂质体[7]。免疫脂质体或配体脂质体的靶向技术是通过将脂质体与单克隆抗体或配体共价结合成免疫脂质体或配体脂质

【浅析非病毒载体基因转移技术的现状和展望】相关文章：

现代信息技术和音乐教学现状论文09-23

浅析我国手机出版发展现状06-01

浅析婚内夫妻共同财产非约定分割的可行性05-30

人脸信息技术应用新热点浅析08-22

浅析当前我国蒙台梭利教育的现状及对策论文04-12

白血病中MLL重排和HOXa9基因表达05-13

浅谈现代教育技术应用的现状与发展04-26

谈高职英语教学现状和改革08-24

浅析环保节能建筑CL结构体系施工技术05-02

浅析广电专用馈电转换电源装置的设计和使用06-01