高效液相色谱法测定芬戈莫德胶囊的溶出度
【摘 要】目的：建立测定芬戈莫德胶囊溶出度的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Agilent ZORBAX-C18，流动相为0.1mol/L的高氯酸钠溶液(用高氯酸调节pH3.0)-乙腈(35∶65，V/V)，检测波长为215nm，进样量为50μl，柱温为30 ℃，流速为1.5ml/min。溶出度测定以pH6.8磷酸盐缓冲液(含0.05%十二烷基硫酸钠)500 ml为溶出介质，转速为100r/min，30min取样。结果：芬戈莫德检测质量浓度在0.2～1.2μg/ml范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系(r=0.9999);精密度、稳定性试验的RSD≤0.6%;平均回收率为99.7%，RSD为0.33%(n=9)。结论：该方法快速、简便、准确，可用于芬戈莫德胶囊的溶出度测定。
【关键词】芬戈莫德胶囊;高效液相色谱法;溶出度
芬戈莫德鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂，于2010年9月美国食品药品管理局(FDA)批准诺华公司的芬戈莫德上市，目前国内无该产品上市。芬戈莫德为近十数年来首个作为一线口服药物用于治疗复发型多发性硬化症(MS)的药物[1]。开发芬戈莫德胶囊将会增加国内该类药物的品种，使临床有更多治疗选择。本品规格为0.5mg，参考美国FDA网站公布的芬戈莫德胶囊溶出度检查方法，选择更具区分能力的溶出介质对芬戈莫德胶囊进行了体外溶出研究，并建立了测定溶出度的反相高效液相色谱(RP-HPLC)法，为评价该品种溶出度提供了一定参考价值。
1、材料
1.1仪器
LC-2010型HPLC仪，包括紫外检测器，LC-solution色谱工作站等(日本岛津公司);RC806溶出度检测仪(天大天发科技有限公司);XP205电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。
1.2药品与试剂
芬戈莫德对照品(重庆华邦制药有限公司，批号：Fin-20150101);芬戈莫德胶囊(重庆华邦制药有限公司，规格：0.5mg，批号：20150301、20150302、20150303);乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为去离子水。
2、方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX-C8(250×4.6mm，5μm);流动相：0.1mol/L的高氯酸钠溶液(用高氯酸调节pH3.0)-乙腈(35∶65，V/V);检测波长：215nm;柱温：30℃;流速：1.5ml/min;进样量：50μl。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备：精密称取芬戈莫德对照品约25mg，置50ml棕色量瓶中，加50%乙腈30ml，超声使溶解，并用50%乙腈稀释到刻度，摇匀，精密量取5.0ml，置50ml棕色量瓶中，并用50%乙腈稀释到刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液。精密量取对照品贮备溶液1.0 ml，置50ml棕色量瓶中，加溶出介质稀释至刻度，超声，摇匀，作为对照品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备取样品，按照溶出度测定法[《中国药典》2010 年版(二部)附录ⅩC第一法]，以pH6.8磷酸盐缓冲液(含0.05%十二烷基硫酸钠)500ml为溶出介质，转速为100r/min，温度37℃，依法操作，经时30min，取溶出液滤过，弃去初滤液3ml，取续滤液作为供试品溶液。
2.2.3空白对照溶液的`制备称取空白辅料0.22g，按照“2.2.2”项下方法配制空白对照溶液。
2.3系统适用性试验
取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱。结果，芬戈莫德的保留时间约为5min，理论板数以芬戈莫德峰计算为6342。
2.4线性关系考察
取“2.2.1”项下对照品储备液，分别精密量取1ml、2ml、4ml、5ml和6ml，置25ml棕色量瓶中，加溶出介质稀释至刻度，摇匀，分别吸取50μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定。以芬戈莫德的质量浓度(x，μg/ml)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程y=374512x+892(r=0.9999)。结果表明，芬戈莫德检测质量浓度在0.2μg/ml～1.2μg/ml范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。
2.5精密度试验
取“2.2.1”项下对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次。结果，芬戈莫德面积的RSD=0.55%，表明仪器的精密度良好。
2.6稳定性试验
取“2.2.2”项下供试品溶液(批号：20150301)适量，分别于放置0、4、8、16、24h时进样，按“2.3”项下色谱条件进样测定。结果，芬戈莫德的RSD=0.42%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
2.7回收率试验
分别称取空白辅料适量，共9 份，分别置于50ml量瓶中，各精密加入上述对照品贮备液4、5、6 ml，加溶出介质溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，分别精密吸取50μl，低、中、高质量浓度各3份，共9份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果，平均回收率为99.7%，RSD=0.33%(n=9)。
2.8样品溶出度的测定
取3批样品，每批6粒胶囊，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定并计算每份的溶出度及每批样品的平均溶出度。结果，3批样品在30min时溶出度均≥标示量的90%。
3、讨论
3.1流动相的选择
芬戈莫德胶囊全部溶于500ml的溶出介质中时，其最大浓度约为1μg/ml，不能用UV法测定。故笔者经试验，建立了以0.1mol/L的高氯酸钠溶液(用高氯酸调节pH3.0)-乙腈(35∶65，V/V)为流动相色谱系统。该色谱系统下，芬戈莫德定量限可达0.02μg/ml(相当于溶出量2%可定量检出)，理论板数按芬戈莫德峰计算大于5000。由于芬戈莫德紫外吸收系数低，为了增加测定准确度和精密度，进样体积定为50?l。
3.2溶出介质的选择
芬戈莫德胶囊口服常规用量0.5mg，芬戈莫德为前体药物，需在体内经鞘氨醇激酶作用形成芬戈莫德磷酸化物之后才能呈现生物学活性。芬戈莫德磷酸化物能与5种1-磷酸鞘氨醇受体中的4种亚型(1、3、4和5型)结合，口服的达峰时间Tmax为12-16小时。因此体外评价本品的溶出将采用在pH6.8磷酸盐缓冲液介质中更为合理。芬戈莫德在pH6.8磷酸盐缓冲液介质中(溶解度为0.12μg/ml)不能达到滤槽条件(3.0μg/ml)，需在溶出介质中加入表面活性剂。参照芬戈莫德胶囊FDA溶出度数据库，笔者认为降低表面活性剂的浓度更能增加溶出介质的区分能力。所以溶出介质选用pH6.8磷酸盐缓冲液(含0.05%十二烷基硫酸钠)，溶出体积为500ml。由溶出曲线可知，其45min已达全溶出，30min为溶出曲线拐点。
3.3滤膜吸附试验
取对照品溶液经0.45μm滤膜滤过，分别弃去初滤液1、3、5、10ml进行比较，发现弃去初滤液3ml后滤膜即再无吸附。故拟定30min时取溶出液滤过，弃去初滤液3ml，取续滤液作为供试品溶液。
综上所述，本方法快速、简便、准确，可用于芬戈莫德胶囊的溶出度测定。
参考文献：
[1]谭强，罗家明，余巨明.芬戈莫德治疗多发性硬化的中枢神经系统作用机制研究进展[J]。中国临床神经科学，2014，22(2)224-227.
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