亲和超滤技术的研究进展

亲和超滤技术的研究进展

　　引言

　　传统的分离和纯化生物产物的方法很多，大都是利用其物理和化学性质的差异，如分子的大小、形状、溶解度、带电性质、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等。而80年代诞生的亲和超滤技术结合了亲和层析与超滤技术共同特点，它既有良好的选择性又易于大规模的操作，从而成为很有前途的分离纯化技术。

　　1 亲和超滤技术的基本原理及其操作体系

　　亲和超滤[1]（Affility Ultrafiltration）是将连有特异性配基的载体（微粒或水溶性高聚物）在适当流动状态下与目标初提液混合，亲和上偶联的亲和配基特异性地与溶液中的目标物配合，形成体积及相对分子质量远大于杂质的复合物。超滤时，复合物被超滤膜截留，而杂质则透过膜被除去，然后用合适的洗脱剂将结合的目标物洗脱下来，该目标物透过膜而得到分离纯化的产品，亲和载体则被截留循环使用。一般而言，亲和超滤技术的体系关键是选择合适的载体、特异性配体以及合适孔径的超滤膜。

　　1。1 载体

　　亲和超滤所用的载体有两类，一类是水不溶性微载体，另一类是水溶性大分子载体。在亲和超滤中，最吸引人的是可采用水溶性高分子为载体，这种聚合物可带有对酶、蛋白质等起抑制作用或亲和作用的官能团，这样亲和作用在均相中进行。水溶性高分子载体有许多优点：亲和载体与目标蛋白在均相体系中反应速度快，达到吸附或洗脱平衡的时间极短，吸附容量大。这一点对亲和超滤很有利，可以将目标蛋白溶液与亲和载体溶液，一边混合，一边进行超滤，而无需另备储槽进行反应；洗脱时也一样。 同时亲和超滤技术也可选用小粒子载体，使其自由地悬浮在提取液中，从而增加了亲和作用几率，也防止了膜的浓差极化和堵塞现象。

　　1。2 配体（配基）

　　配基是亲和过程的核心物质，在分离中起特异性吸附欲分离物的作用。配基一般分为天然配基（包括糖结合配基和蛋白质结合配基）、染料配基、氨基酸类亲和配基、核苷酸及核苷酸类似物配基和仿生配基等几类。配基与欲分离物吸附作用的大小主要与配基的空间结构有关，它们与载体的连接方法也关系到洗脱过程。但它们之间的结合力仍不外乎对应的功能基团之间的氢键、静电作用、疏水作用等。

　　在亲和超滤过程中，大规模连续生产要求吸附（亲和） 和解吸迅速。 因此，配基与欲分离目标产物之间的亲和力要控制在一定的范围之内，若亲和力太低，则分离的效果不好；若亲和力太高，则洗脱太困难。同时为了提高吸附量，配体必须有足够的接触面积（粒子尽可能小或呈多孔结构） 并且应廉价、专一性强，在亲和洗脱条件下很稳定，在高剪切力下无损伤，易回收、无毒。 若配体为小分子物质，则必须固定于载体表面。

　　1。3 超滤膜

　　超滤膜一般为高分子分离膜，是一种具有超级“筛分”分离功能的多孔膜。它的孔径只有几纳米到几十纳米。在膜的一侧施以适当压力，就能筛出大于孔径的溶质分子，以分离分子量大于500 道尔顿、粒径大于2～20 纳米的颗粒。超滤膜根据膜材料的不同，可分为无机膜和有机膜，而膜的结构则有对称和非对称之分。

　　亲和超滤过程的透过速率由超滤膜的孔径或截留分子量决定。选用截留分子量大的超滤膜可提高透过速率。由于超滤膜分离的选择性较低，选用载体的分子量应至少比亲和体的分子量大10 倍[2]。此外，超滤膜在使用过程中会受到吸附、沉淀和生物等污染，使得超滤膜化学清洗频率较高，而且超滤膜的制造成本相对较高，膜寿命较低。上述问题，使得超滤膜工艺的运行能耗和运行成本中折旧费用增加，因此人们一直在不断开发研究各种新型超滤膜[3—6]，以期满足工业生产的需要。

　　2 亲和超滤技术和传统的亲和层析及过滤技术的比较

　　亲和超滤技术是亲和层析技术和超滤技术的有机结合，与这两者相比，亲和超滤技术在物质分离纯化方面拥有自己独特的特点。

　　2。1 亲和超滤技术和传统的亲和层析技术的比较

　　亲和层析[7]（Affinity Chromatography）是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的方法。它具有很高的选择和分离性能以及较大的载量，只需要一步处理即可使待分离的生物大分子从复杂的混合物中分离出来，达到千倍以上的纯化，并保持较高的活性[8]，是分离纯化以及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。

　　与传统的亲和层析技术相比，亲和超滤在全混搅拌池中进行，全部起始物料同时参与亲和载体结合，对可溶性载体或超细颗粒载体，反应能在瞬间达到平衡。由于可溶性载体配基与目标蛋白结合的空间位阻小，配基能较为有效地发挥作用，因而吸附容量大，能在短时间内处理大体积物料。当物料比较稀，体积比较大时，采用亲和超滤比亲和层析更为合适。当被纯化产物浓度高，体积小时，采用亲和层析更为合适。

　　但亲和层析常有如下问题[9] ：（1）层析柱易于阻塞和污染，使用寿命短；（2） 受基质限制， 柱效降低；（3）在层析过程中，底物被吸附和洗脱的过程缓慢，分离周期延长； （4） 某些配基与底物可存在多点的相互作用，这可能会造成峰分裂和不可逆吸附现象等。

　　2。2 亲和超滤技术和传统的超滤技术的比较

　　传统的超滤过程是以压力为推动力，溶质按分子量大小不同而分离，比膜孔小的溶质和溶剂（水）一起透过膜，而较大的溶质则被截留。这是一个非常简单的过程，不包括相变化，不需要加入化学试剂，而且能耗小，易于大规模操作。如孙x等[10]用超滤法纯化大黄多糖；夏光辉[11]将超滤技术应用于葡萄酒加工；刘春霞[12]等用超滤技术处理饮用水。但刘春霞等也指出：超滤技术选择性差，不能将分子量相近的生物大分子分开。而亲和超滤技术可以很好解决这一难题，亲和配基（配体）能特异性的与目标产物相结合，与待分离物质分离。

　　3 亲和超滤技术的应用

　　亲和超滤技术可从稀溶液中专一地提纯生物大分子。过程中不需要为了分离目标物而引入新的化学杂质和苛刻的操作条件，亲和载体与目标产物具有很好的生物及化学相容性，可避免产品的生物活性受到损伤。亲和作用在均相或微粒—液相体系中进行，吸附与洗脱扩散阻力小，所有亲和载体同时参加吸附或洗脱过程，载体利用率和过程速率大为提高，可实现大规模连续化操作。目前，亲和超滤技术已经在蛋白质分离、酶分离、手性拆分等领域获得了广泛的应用。

　　3。1 亲和超滤在蛋白质分离方面的应用

　　蛋白质是生命的物质基础，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。纯蛋白在食品，医药，化妆品等行业有着极其重要的作用。

　　Mattiason 等[13]利用热杀死酵母细胞为载体，细胞表面存在的糖为配基，从刀豆中提取伴刀豆蛋白，用分子截留值30 万—100 万的超滤膜过滤，以葡萄糖为洗脱剂，最后得到纯产品，收率为70%以上。Power 等[14]将生物素共价结合到平均粒径为74nm 脂质体上，制成亲和载体用于从含有溶菌酶和细胞色素C 的模拟杂质中分离抗生素蛋白，回收率为50%。

　　Rao 等[15]使用蓝色染料为亲和配基，再生纤维素膜共价结合一个磺酸基从而形成带负电的过滤膜，通过两者之间的静电相互作用来分离牛血清白蛋白和卵蛋白。结果表明牛血清白蛋白纯化了90 多倍，收率大于90％。并指出，使用小的带电亲和配体可提高蛋白质分离的潜力。

　　3。2 亲和超滤在酶分离的应用

　　通常酶也是蛋白质，但酶又不完全等同于蛋白质，有着自己独特的性质。酶的催化作用有如下特性：高效性、专一性、多样性、温和性。因此，酶的分离纯化工艺往往更加苛刻。

　　Male 等[16]采用在无氧的条件下，经N—丙烯酰—间— 氨基苯甲脒和丙烯酰胺共聚而成的聚合物作为大分子配体，采用亲和超滤技术从人尿液中分离纯化尿激酶。整个亲和超滤过程尿激酶的收率为49 % ，所得的尿激酶的比活力接近于最高商品级。由于人尿液中还含有其它分子量很高的组分，因此需要在亲和超滤分离纯化尿激酶前，需要对其进行预处理[17]。

　　Teke 等[18]用亲和超滤技术分离纯化牛胰磷脂酶A2 （PLA2）。这种方法是基于壳聚糖—磷脂酰乙醇胺的合成树脂为亲和载体，在Ca2+存在条件下进行亲和超滤，最后以EDTA 为洗脱剂，结果显示该酶被纯化79 倍，活性回收率为76。3％。

　　Luong 等[19]采用与Male 实验用的相同大分子为配体，与提取液中的胰蛋白酶相互作用形成复合物，然后使用连续亲和超滤技术，使胰蛋白酶—大分子配体复合物被截留而其它杂质则通过膜，用精氨酸或氨基苯甲脒对复合物进行洗提，从复合物中分离出胰蛋白酶。连续亲和超滤技术从猪胰腺中分离纯化胰蛋白酶的产率高，所得产品纯度高。而Powers 等则采用改性脂质体作为大分子配体，以亲和超滤技术来分离和纯化胰蛋白酶。

　　Mukherjee 等[20]考察了聚醚膜和聚乙烯膜两种不同的膜来分离纯化胰蛋白酶的能力，比较了两种膜（截留分子量均为30 kDa）的相对性能。研究表明：两种膜在提取胰蛋白酶活性相近（聚醚膜为74％，聚乙烯膜为70％）的前提下，使用聚醚膜的总蛋白回收率（70％）是聚乙烯膜（46％）的的1。5 倍。在亲和超滤的洗涤和洗脱阶段，聚醚膜均比聚乙烯膜有利于持续进行蛋白质分离。

　　Vedajnananda[21]等进行了半连续—亲和超滤分离纯化胰蛋白酶的数学模拟。实验使用再生纤维素膜（截留分子量：30 kDa）为超滤膜，大豆胰蛋白酶抑制剂为亲和配体，从胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物中分离纯化胰蛋白酶。实验中二者的浓度为0。02 毫克/毫升，浓度比例一直维持在50：1，超滤的压力在199。4—395。5 千帕范围。结果：在160 秒内，胰蛋白酶的浓度从超滤模拟系统中它的初始值下降至零，而胰凝乳蛋白酶的浓度下降到零则用了300 秒。从而证明了使用半连续—亲和超滤分离纯化胰蛋白酶的可行性。

　　3。3 亲和超滤在手性拆分方面的应用

　　许多有机化合物分子都有“对映异构体”，即具有“手性”。如α—氨基酸，在碳连接有一个羧基、一个氨基、一个烃基和一个氢原子（或一个不同于前边的烃基）。由于对映体之间理化性质的相近，分离和合成出纯净的对映体一直是人类梦昧以求的事业。目前亲和超滤技术分离手性化合物的研究中以氨基酸的研究居多。

　　Poncet 等和Garnier 等[22]都采用牛血清蛋白作为大分子配体来拆分色氨酸消旋体，当溶液的pH 值为9 时，采用单级亲和超滤技术分离出的D — 色氨酸的纯度为91 % ， 整个过程拆分回收率为89 %。而Romero 等[23 ]采用相同的大分子配体来拆分色氨酸消旋体，采用二级亲和超滤技术，则可使分离出的L — 色氨酸的纯度大于90 % ，整个过程的回收率为60 %，并指出采用二级亲和超滤技术可以有效的避免截留滞留物（复合物） 的累计，因此可获得更高的提纯倍数。

　　Overdevest 等[24]采用具有对映选择性的胶束作为大分子配体，通过亲和超滤技术来拆分苯丙氨酸消旋体。在该过程中，具有对映选择性的胶束优先与一种对映异构体结合而形成复合物，而未结合的对映异构体则通过超滤膜。

　　倾斜超滤技术可以连续不断的去除滤饼， Iritani 等[25]使用亲和倾斜超滤技术分离色氨酸对映体：以牛血清蛋白为立体选择性配基，使用垂直放置的单通模式的中空纤维膜为超滤膜，在pH 值7 的条件下进行分离。结果表明：右旋色氨酸优先和牛血清白蛋白结合，过滤速度与牛血清白蛋白的浓度相关，但并未受到浓缩物流速的影响，因为堆积于膜上的滤饼即使在很低的流速下也可以在重力的作用下被移除。

　　Romero[26]采用模拟系统分析亲和作用力受溶液的pH 值和盐的浓度的影响。实验以牛血清白蛋白为亲和配基来分离的D —和L —色氨酸对映体， 结果表明L —色氨酸和牛血清白蛋白的最大结合度是在pH 值为7 至10，在这个PH 范围之类纯化度显着增加。

　　4 展望

　　亲和超滤技术作为一种新兴的分离纯化技术，具有亲和层析和膜过滤的优点，不仅利用了生物分子的识别功能，而且操作简单、易于放大，是现代分离工程的一项重要技术。对亲和超滤进行的一系列研究结果表明，亲和超滤技术具有较大的实际应用价值。另外，虽然亲和过滤在分离纯化酶和蛋白质等生物大分子方面的优越性很多，但是其应用领域仍然不够，特别是国内的此方面分离科学研究，目前几乎未见相关报道，亟待引起重视和发展。此外，亲和超滤技术本身还有诸多疑难点，如减少非特异性吸附，载体的反复利用后的污染等问题尚待解决，相信随着亲和过滤技术的不断完善，在不远的将来会走上工业化应用之路。

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