生物酶解破壁提制葛根黄酮的工艺
引言
葛根富含葛根淀粉和总黄酮（含量约为1-12%）。由于我国农作物利用较粗放，葛产业基本上集中在葛根淀粉的提取[1]，淀粉中异黄酮含量仅占葛根总黄酮的2.4％，95％以上尚留在葛根废渣被丢弃，高附加值的天然活性成分浪费严重。作为医药和保健食品的原料或添加剂[2]，目前，国际市场葛根黄酮每年需求量约在500－800 吨，在美国，食用酮类食品的人数超过１亿３千多万人；而我国的每年需求量约在150 吨左右。将生物酶促法应用到葛根黄酮的提取，主要是利用微生物充分破坏植物细胞组织结构，将植物组织分解成小分子物质，减少提取传质阻力，充分释放活性成分，具有提取物稳定、纯度高、能耗低、有机溶剂使用量少等特点[3]；目前，汤海鸥[4]、施英英[5]等采用纤维素酶和木聚糖酶等对提取葛根黄酮进行报道。随着人们对葛根功能性和营养性研究的深入，采用生物酶化工艺，在减少葛产业集约化发展引起的葛根废渣环境污染的同时，实现葛根废渣的资源化利用提供一条新途径。
1 主要仪器、试剂和测试方法
1.1 仪器与试剂
仪器：UV-2450 紫外可见光光度计，DELTA 320-5pH 计，RE-2000 旋转蒸发器，126P/166P高效液相色谱仪，SPX-250-Z 振荡培养箱原料：葛废渣取至重庆北碚农村（除去葛根淀粉）试剂：葛根素（标品）；乙醇（分析纯）、正丁醇（分析纯）、硫酸(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)、葡萄糖(分析纯)、甲醇(分析纯)
1.2 实验
1.2.1 菌种培育
选用黑曲霉，分别经过斜面培养、种子液体培养后，将培养好的菌种接种装入液量为60 ml250ml 三角瓶中，接入量为5%，29℃，180rpm，混合培养48h。
1.2.2 微生物酶化提取葛根黄酮
取烘干、粉碎后过40 目筛的葛渣样品3.5g，加入豆粕1.0g 至250ml 干净的锥形瓶中，加入蒸馏水，接入一定量种子液, 设定pH 值和发酵时间，考察接种量和培养基质及不同工艺参数对葛根黄酮溶出的影响
1.2.3 主要控制参数及发酵工艺流程
葛根渣与辅料之比为7:2，固液比为1:20，接种量50%，发酵温度为30℃，发酵时间为60h，pH 值为5，豆粕的重量百分量为5%～25%；接种量为40%；pH 值为6，在30℃下连续反应48h 反应在生化培养箱中进行，间歇通过无菌空气(平均 10min/h)
1.3 葛根黄酮的测定
采用色谱分析方法[6]测定葛根素标品。精密称取葛根素标准品5.2mg，经甲醇定容并配置成1.04mg/ml 的标准溶液后，分别移取1ml、0.5ml、250ul、100ul、50ul、25ul、5ul 标准溶液，再用甲醇稀释并定容至5ml；设定色谱条件为色谱柱C18，柱温30℃，流动相为：甲醇-水（25：75），检测波长为250nm，流速为1.0ml/min，进样体积为10ul；通过分析检测得出峰面积绘制葛根黄酮的标准曲线。得回归方程为：y=35415x-14502， R?=0.9993。
2 结果与讨论
2.1 不同方法的对比实验
2.1.1 葛渣不同处理方式对葛根黄酮含量影响
葛根黄酮等植物有效成分大都被包裹在葛渣细胞壁中。微生物能产生木聚糖酶和内切-β-葡聚糖酶(CMC 酶)，破坏葛渣细胞壁的纤维结构，甚至将其分解成小分子物质，减少提取传质阻力，有效释放葛根黄酮等活性成分。通过图2 葛渣不同处理方式的对比可知，采用黑曲霉和康宁木霉发酵36h 后所得葛根黄酮的含量均高于未发酵处理，其中黑曲霉在发酵60h 时葛根黄酮含量达到最高，为1.078ug/ml。
2.1.2 不同发酵方式对葛根黄酮含量影响
不同菌种对生长环境要求不一样。从图3 可知，采用黑曲霉进行好氧发酵在每一时段其葛根黄酮浓度均大于厌氧发酵产量，且在60h 时能得到葛根黄酮的最大浓度为1.078ug/ml。
原因在于：黑曲霉生长会产生酶，加快葛渣纤维组织降解能力；在这过程中，充足的氧气会促使微生物生长，增加酶产生量，从而促进葛渣纤维组织的降解，提高葛根黄酮的溶出量。