响应面法优化耐有机溶剂脂肪酶营养条件
摘要：本文以响应面法对蜡状芽孢杆菌SWWL6 液体发酵产酶的营养条件进行优化。经单因素实验确定发酵产酶的最佳碳源、氮源及无机盐分别为可溶性淀粉、酵母膏、NH4NO3、MgSO4? 7H20 和NaCl。采用部分因子分析法研究初始发酵培养基各种组分对产酶的影响程度，发现酵母膏、NH4NO3 的质量浓度对产酶的影响显著。通过最陡爬坡实验逼近最大响应区域。中心组合设计和响应面分析法确定最优培养基组成为酵母膏0.64%、NH4NO3 0.384%、可溶性淀粉1%、MgSO4? 7H20 0.1%，NaCl 0.25%，甲苯20%。优化后相对酶活比优化前的提高了3.48 倍。
关键词：耐有机溶剂；脂肪酶；响应面法；蜡状芽孢杆菌
0 引言
脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是一类重要的甘油酯键水解酶，可以在油水界面上催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油。在特定的非水相系统中，还可催化水解反应的逆反应，以及酯化合成和转酯反应。从催化特性来看，脂肪酶具有化学选择性、高度的立体异构专一性、不需辅酶、高效、反应条件温和、无毒、副产物少等优点。近年来，随着非水相酶学的不断深入，脂肪酶的应用已超出了水相中水解反应的范围，被广泛应用于有机相中酯的合成、手性化合物的拆分、高聚物的合成、肽合成、生物柴油的合成等方面，具有广阔的应用前景。有机合成大多数是在有机介质中进行的，而有机溶剂则易引起蛋白质的变性，使酶失活，因此限制了酶在有机合成中的应用[1]。如果一种脂肪酶能在高浓度的有机溶剂中具有稳定性，就能很好的解决催化环境受限的问题，使酶的催化反应更容易化，同时降低了酶的生产成本。
因此耐有机溶剂脂肪酶的研究具有非常重要的意义。目前，关于耐有机溶剂脂肪酶的研究多见于国外报道，日本的Ogino H 等人筛选到有机溶剂耐受菌Psudomonas aeruginosaLST-03[2]。国内鲜见报道，尤其是关于蜡状芽孢杆菌脂肪酶还没有见到报道。
随着计算方法的完善和微机应用的普及，响应面方法已被成功应用于科学研究的许多领域[3、4]。它是一种优化工艺条件的有效方法[5]，采用更为合理的试验设计，能以最经济的方式对试验进行全面研究。该方法已被广泛地用于同时存在多因素影响的实验优化上。本文结合了单因素实验、部分因子实验、响应面法对Bacillus cereus SWWL6 发酵培养基进行了优化，从而提高脂肪酶的产量，为耐有机溶剂脂肪酶的进一步分离纯化、酶学性质及应用研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 试验菌株蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）SWWL6 吉林农业大学生命科学学院生物工程研究室保藏菌株。
1.2 培养基及培养条件斜面培养基：橄榄油0.1%，蛋白胨1%，酵母浸膏0.5%，NaCl 0.5%，琼脂2%，pH 7.0种子培养基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母粉0.2%，pH 7.0发酵培养基：橄榄油1%，酵母浸膏0.5%，MgSO4·7H20 0.1%，NaCl 0.25%,甲苯20%，pH 7.0将斜面活化后的菌种接至装有50mL 种子培养基的250mL 三角瓶，30℃，150r/min 培养24h，制得种子液。以5％接种量转接到装有40 mL 发酵液的250 mL 三角瓶中，30℃，150r/min 条件下培养48h。发酵液于8000r／min 离心15min，取上清液测定酶活力[6、7]。
1.3 酶活力测定方法脂肪酶的活力测定采用分光光度计法[8]。在刻度试管中加入1mM p-NPP 溶液lmL 和50mM Tris-HCL 缓冲液(pH8.0)lmL，两者充分混匀后于38℃水浴中保温5min，向测定管加入适当稀释的待测酶液0.1mL，以加热灭活的待测酶液作为空白对照,反应15min 后快速取出，定容至7.5mL 于分光光度计4l0nm 下测定酶催化产生的对硝基苯酚（pNP）的吸光值。脂肪酶 1 个酶活力单位的定义(U)：在上述条件下，每分钟水解p-NPP 产生1μmol 对硝基苯酚(pNP)所需的酶量。
1.4 单因素实验