鼠源抗柑橘溃疡病菌Fab抗体库的构建

时间:2020-08-10 12:45:05 硕士毕业论文 我要投稿

鼠源抗柑橘溃疡病菌Fab抗体库的构建

  1 引言
  柑桔溃疡病是由地毯草黄单胞杆菌柑桔致病变种( Xanthomonas axonopodis pv. citri) 引起的一种国内外重大检疫性病害,给世界柑桔产业带来了巨大经济损失。病菌主要随罹病种苗等繁殖材料远距离传播,生产上常用的铜基杀菌剂和抗生素制剂对其防效不佳[1],探索柑桔溃疡病的防治新途径在目前和将来都具有重大意义。基因工程重组单抗兼具治疗和诊断双重功能,利用抗原-抗体特异性结合原理,可用于人类疾病、植物病害的诊断、治疗和预防。

  近年来发展起来的噬菌体抗体库技术使人们可以绕开细胞杂交瘤技术,直接从基因水平制备特异性单链抗体,由此开创了简便、快速生产基因工程抗体的先河,被认为是继杂交瘤技术后抗体生产技术的又一次革命[2,3]。20 世纪80 年代中期,Smith[4] 等提出了噬菌体展示技术,到90 年代初,Winter 等在前人的研究基础上创建了噬菌体抗体库技术,将噬菌体展示技术应用到抗体工程领域,彻底改变了制备抗体的传统途径,使抗体技术进入到了基因工程抗体时代。近年来噬菌体抗体库技术已经成功应用于医学研究及疾病诊断方面,但应用在植物病害方面研究的报道却寥寥无几[5,6]。Fab 抗体是由抗体轻链片段及重链的Fd 段组成的,与单链抗体ScFv 相比,具有稳定性更好的特点,且可直接在大肠杆菌中表达有活性的抗体,制备简单,省去了复性等繁琐的步骤。本研究采用噬菌体抗体库技术,以经过多次免疫的小鼠脾细胞mRNA 为基础,扩增出抗体轻链及重链Fd 段分别连接到噬粒载体中构建噬菌体抗体库,为后面的研究奠定基础。

  2 材料与方法
  2.1 材料
  2.1.1 实验动物
  6~8 周龄BALB/c 小鼠4 只,均购自第三军医大。

  2.1.2 菌株及载体
  噬粒 pComb3XSS 由美国Barbas 实验室馈赠;Top10 F’、辅助噬菌体VCSM13 为本中心保存;大肠杆菌(Escherichia coli)XL1-Blue 由重庆工学院馈赠。

  2.1.3 试剂及耗材
  TRIZOL 购自Invitrogen 公司;M-MLV 反转录酶购自Promega 公司;限制性内切酶SacⅠ、XbaⅠ、SpeⅠ、XhoⅠ及T4 DNA 连接酶均购自NEB 公司;其它试剂为国产分析纯。

  2.1.4 引物
  参照美国 Scipps 研究所鼠源抗体库构建的引物及《实用分子生物学操作指南》[7]设计简并引物,由上海生工合成。

  2.2 方法
  2.2.1 动物免疫
  将柑桔溃疡菌用生理盐水稀释至 1×108CFU/ml,取0.5 ml 腹腔注射6~8 周龄BALB/c小鼠,每周免疫一次,免疫4 周后用ELISA 法测血清效价,加强免疫3 天后取脾,并用无菌注射器针柄在200 目的不锈钢滤网中将脾脏分离成单个细胞,加入Eppendorf 中,离心去上清,用液氮速冻后70℃保存。

  2.2.2 提取RNA 及cDNA 第一链扩增
  按照 Trizol 试剂盒说明书提取小鼠脾脏RNA,通过凝胶电泳及测OD 值确定RNA 的质量。以Oligo-dT 为引物反转录合成cDNA 第一链。

  2.2.3 PCR 扩增轻链及重链Fd 段基因
  通过温度梯度摸索 PCR 反应条件为94℃ 50s,57℃ 50s,72℃ 10min,35 个循环,PCR产物在1.5 %琼脂糖凝胶电泳验证, 采用凝胶DNA 回收试剂盒回收PCR 产物。

  2.2.4 鼠源抗柑橘溃疡病菌Fab 抗体库的构建
  将 κ 链基因 PCR 产物与 pComb3xss 分别用 SacⅠ/XbaⅠ消化,经琼脂糖电泳分离并纯化回收, 取1.0 μg 载体片段与0.2 μg κ 链片段在80 μL T4 DNA 连接酶反应体系中进行连接反应, 经沉淀回收后电击转化XL1- Blue 感受态细菌, 加入2 mL SOC,37℃、250rpm 培养1 h 后取少量铺盘测定, 其余加入100 mL 含50 μg /mL 氨苄青霉素和10 μg/mL 四环素的 SB 培养液中培养过夜。提取质粒, 得到轻链库。再分别将轻链库与Fd 段用 SpeⅠ/XhoⅠ酶切后回收,按前法进行连接、转化、细菌扩增及转化子测定。在加入100mL SB 培养液1 h 后加入1 mL 约1012 pfu 的辅助噬菌体 VCSM 13,再培养2 h 后,加卡那霉素至70 μg/mL,37 ℃振荡过夜。次日离心收集上清, 加 PEG8000 至4%、NaCl 至3%,冰浴30min,4℃、9 000 r /min 离心20 min, 弃上清, 用2 mL 1%的BSA- PBS 溶解沉淀, 12000 r /min 离心5 min, 弃去不溶性沉淀, 所得上清即为 Fab 噬菌体抗体库。