RPHPLC法测定阿魏酸衍生物的含量测定的方法论文

时间:2020-06-30 10:57:30 生物科学毕业论文 我要投稿

RPHPLC法测定阿魏酸衍生物的含量测定的方法论文

  阿魏酸衍生物(BL)是对阿魏酸(Ferulic Acid,4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)苯环进行改造后的化合物,是一个良好的抗氧化剂[1]。文献[2]报道其清除自由基的能力比阿魏酸明显增强。BL结构中溴原子的引入[2],不仅提高了清除自由基的能力,还明显增大了脂溶性,这有利于其在生物体内的转运与吸收。本文参照文献[3-6]建立了反相高效液相色谱方法,用于测定BL含量及其有关物质,为其质量的可控奠定基础。

RPHPLC法测定阿魏酸衍生物的含量测定的方法论文

  1 仪器与试剂

  Waters 600-717-996高效液相色谱仪(二元泵,二极管阵列检测器,自动进样器,Millennium32色谱工作站);电子分析天平(Sartorius,BP211D);KQ3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);甲醇(色谱纯,禹王试剂);乙酸(分析纯,国药集团);水(娃哈哈纯净水);30%H2O2(分析纯,国药集团);盐酸(分析纯,国药集团);氢氧化钠(纯度:96.0%,西陇化工有限公司);BL对照品(批号:20121101纯度:99.91%,由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供);BL供试品(由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供,批号分别为20130201,20130202,20130203)。

  2 色谱条件与系统适用性试验

  采用Agilent Eclipse C18(250mm×4.6mm,5?m)色谱柱;流动相:甲醇-0.1%乙酸(42:58,V/V);紫外检测器检测波长228nm;流速1.0mL·min-1;进样量20?L;柱温:40℃。理论塔板数以BL计算不低于5000,分离度大于1.5,色谱图见图1(主峰保留时间:14.5min,杂质1保留时间:5.8min,杂质2保留时间:12.8min,杂质3保留时间:38.8min)。

  3 溶液的配制

  3.1 对照品溶液

  取BL对照品约10mg,精密称定,置50mL棕色量瓶中,加适量甲醇超声助溶,冷却至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。

  3.2 供试品溶液

  取BL供试品约10mg,精密称定,置50mL棕色量瓶中,加适量甲醇超声助溶,冷却至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。

  4 方法专属性考察

  分别精密称取BL供试品约20mg,置3个25mL棕色量瓶中,加甲醇适量,超声助溶,进行如下破坏试验:①酸破坏:加1mol·L-1盐酸1mL,室温下静置17h,用1mol·L-1氢氧化钠中和,加甲醇稀释至刻度,摇匀;②碱破坏:加1mol·L-1氢氧化钠4mL,室温下静置65h,85℃水浴2.5h,冷却至室温,用1mol·L-1盐酸中和,加甲醇稀释至刻度,摇匀;③氧化破坏:加30%双氧水8mL,室温下静置62h,85℃水浴2.5h,冷却至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀。

  按照“2”项下的'色谱条件,分别取各破坏溶液20?L进样,记录色谱图,见图2。 通过破坏试验可以看出BL 在碱、氧化条件下比较稳定,放置期间有关物质略有增加,在酸性条件下极不稳定,有关物质增加明显,但有关物质均与主峰分离良好,不干扰样品测定,说明该方法专属性好。

  5 方法学考察

  5.1 线性关系考察

  精密称取BL对照品(批号:20121101)约4mg、6mg、8mg、10mg、12mg、14mg、16mg分别置于50mL棕色量瓶中,加适量甲醇超声助溶并稀释成约0.08mg/mL、0.12mg/mL、0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL、0.28mg/mL、0.32mg/mL的梯度对照品溶液。分别取上述溶液20?L进样测定,记录色谱图。以峰面积A对浓度C(mg·mL-1)进行线性回归,得回归方程 A=84486C-327332(r = 0.9996),表明BL在0.08~0.32mg·mL-1浓度范围内呈良好线性关系。

  5.2 仪器精密度试验

  取浓度为0.20mg/mL对照品溶液,连续进样6次,每次20?L,以峰面积计算,所得RSD为0.57%(n=6),表明测定时的仪器精密度良好。

  5.3 重复性试验

  取同一批号的BL供试品按“3.2”项下方法操作,配制成0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL的低、中、高3个浓度的标准溶液,每个浓度平行配制3份,共9份,照“2”项下色谱条件测定,按外标法以峰面积计算样品含量,测得平均含量为100.35%,RSD为0.50%(n=9),表明方法重复性良好。

  5.4 稳定性试验

  取室温下放置的低、中、高3个浓度的供试品溶液,各取20?L在0,4,6,8,10,12h的条件下,按照“2”项下色谱条件测定峰面积,测得RSD分别为1.7%、1.4%、1.3%,表明供试品溶液在12h内稳定。

  5.5 检测限与定量限

  精密吸取“3.1”项下对照品溶液,加甲醇逐级稀释,进样,记录色谱图,在信噪比(S/N)为3:1时测得检测限为8ng,在信噪比(S/N)为10:1时测得的定量限为36ng。

  6 样品含量测定

  按“3”项下的方法分别制备对照品溶液和供试品溶液,各取20?L进样,按外标法以峰面积计算样品含量,结果表明,3批样品含量均在99.0%以上(见表1)。

  7 有关物质测定

  取BL供试品约20mg,精密称定,置25mL棕色量瓶中,加甲醇适量,超声助溶,冷却至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀,得0.80mg/mL的溶液作为供试品溶液。精密移取此溶液适量,用甲醇稀释100倍,得自身对照溶液。以不加校正因子主成分自身对照法计算有关物质的含量[7]。结果表明,有关物质均在1%以内(见表1)。

  8 讨论

  8.1 波长的选择

  取BL对照品溶液进行紫外扫描显示其最大吸收波长在228nm和317nm处,其中228nm处的吸收值最高,因此选择228nm用于BL的含量测定,保证测定时有较高的灵敏度。

  8.2 柱温的选择

  考察了25℃、30℃、40℃的不同柱温下对样品分离效果的影响,实验表明,采用40℃的柱温,可减小流动相粘度、降低柱压、缩短出峰时间并改善分离效果,故将柱温定为40℃。

  8.3 流动相的选择

  根据BL的化学性质,考虑采用酸性流动相可以获得较好效果。经过实验比较采用甲醇-乙酸-水系统作为流动相,并且变换流动相比例和乙酸浓度,最终确定流动相为甲醇-0.1%乙酸(42:58,V/V),此条件下分离效果最好,保留时间适中。

  8.4 稳定性考察

  由于BL的结构特性,通常在溶液中不稳定,且见光易分解[8-9],考察了BL溶液在透明量瓶和棕色量瓶中的稳定性,发现BL溶液在透明量瓶放置8小时后含量显著降低,而在棕色量瓶中的放置12小时含量变化不大,RSD小于2.0%,但是随着时间增长含量仍会缓慢降低。故在试验过程中需采取避光措施,并于配制后尽快使用。

  8.5 结论

  综上所述,本方法操作简便且检测限、定量限、精密度、重复性等均符合要求,故本法适用于对BL含量及其有关物质进行测定,对于BL的质量控制和使用安全有着十分重要的意义。

  参 考 文 献

  [1] 徐敬侠,张首国,王林,等.5-溴阿魏酸的合成研究 [J].化学试剂,2012,34(5) :463-466.

  [2] 黄华永,张鲁勉,郑锦鸿.5-溴阿魏酸的合成及其清除自由基研究 [J].汕头大学医学院学报,2005,18(3) : 129-131.

  [3] 李全斌,何开勇,吴建萍.阿魏酸含量测定方法研究进展[J].中医药导报,2011,17(3): 117-119.

  [4] 黄罗生,郭健新,刘咏梅,等.HPLC测定阿魏酸含量的探讨[J].中成药,2004,26(2): 134-136.

  [5] 何玲玲.高效液相色谱法测定当归养血丸中阿魏酸含量[J].中国医药导报,2011,8(3): 60-62.

  [6] 顾民,张亮,张正行.HPLC测定逍遥散及当归中阿魏酸的含量[J].中成药,2000,22(5): 342-344.

  [7] ChP(中国药典).2010.VolⅡ(二部):Appendix (附录)V D

  [8] 夏明,董晓烨.当归养血丸中阿魏酸的含量测定[J].医药导报,2010,29(1):103-104.

  [9] 马宏达,李阳,赵庆春,等.高效液相色谱法测定天宁颗粒中阿魏酸含量[J].医药导报,2012,31(7):918-920.

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