5-氨基苯并咪唑酮类衍生物的设计与合成论文
随着全球人口的急剧老龄化, 神经退变性疾病已成为一个严重的问题, 其中阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD) 已经成为人类晚年精神衰竭的最普遍的形式。AD 是一种神经退变性疾病, 临床表现为认知和记忆功能不断恶化, 日常生活能力进行性减退, 并有各种神经精神症状和行为障碍。尽管其发病机制还没有完全阐明, 但研究表明, AD 患者脑中低的乙酰胆碱水平、β-淀粉样蛋白 (β-amyloid, Aβ) 的异常增加与沉积以及氧化损伤等在AD 的发病机制中起着重要的作用。
目前AD 主要具有3 种特征性的病理表现: 神经传递基质乙酰胆碱水平的降低、患者大脑小半鞘翅中β-淀粉样蛋白增加[和Tau 蛋白 (含量最高的微管相关蛋白) 的过度磷酸。人们还在为探索AD 的病因做着更多、更新的研究。目前治疗AD 以乙酰胆碱酯酶抑制剂 (AChEI) 为主, 如利斯的明 (rivastigmine)、他克林 (tacrine)、多奈哌齐 (donepezil)、加兰他敏 (galanthamine) 和石杉碱甲 (huperzine-A)等。但是已经开发的这些药物无法完全满足临床的需求, 需要进一步开发高效低毒的药物来满足社会的需要。
近来报道了1 个新化合物Ⅰ及其类似物, 对抑制AChE 有非常好的效果, 其IC50 值达到了0.51 μmol·L1。有文献报道化合物含有富电子 (如甲氧基) 的芳香基团, 能够与AChE 的外周阴离子结合部位 (peripheral anionic site, PAS) 结合。化合物Ⅰ的A 官能团拥有甲氧基、苯环和噻唑环, 都有很丰富的电子, 使它能很好地结合PAS位点, 因而拥有极好的活性。本文依据生物电子等排原理, 用A1 官能团代替A 官能团, A1 官能团由苯环和咪唑酮环组成,电子同样富有, 而且A1 官能团的电子更为集中, 预想它能与PAS 部位更易结合且更稳固; 在对先导物化合物进行合理生物电子等排取代时, 用苯环代替噻唑环, 咪唑酮代替苯环, 使其参数 (键角、杂化、电子分布、电荷等) 尽可能的保留, 进一步稠合成苯并咪唑酮结构。
本文研究治疗AD 的出发点是从抑制乙酰胆碱酯酶着手。随着乙酰胆碱酯酶晶体结构的研究, 发现人的.AChE 的活性部位是一个由表面向内部伸展的狭长通道, 呈哑铃型, 通道开口处和底部比较开阔,中间狭窄。开口处富含带负电荷的氨基酸残基如酪氨酸、色氨酸和天冬氨酸等, 该位置被称为外周阴离子结合部位, 底部是AChE 的催化活性中心 (catalysisactive site, CAS)。研究发现, AD 患者脑中高活性AChE 多聚集在神经斑块和神经纤维结处, 而且AChE 的PAS 部位能促进Aβ 蛋白的形成并加速其沉淀。这些研究表明, AChE 可能在AD 发展过程中起着多重作用, 因此同时作用于AChE 的CAS 部位和PAS 部位的双位点抑制剂可能对AD 治疗有多重作用机制。因此本文对化合物Ⅰ另一部分修饰就是延长或缩短碳链, 寻找能同时作用于AChE 的CAS 部位和PAS 部位的双位点抑制剂, 也就是B1 官能团代替B。最终合成新的化合物Ⅱ并考察它们对AChE的抑制作用, 为新的AChEI 的开发做探索性研究。本文以5-氨基苯并咪唑酮为原料, 经过酰胺化反应, 生成化合物1～4, 化合物1～4 与二级胺反应生成目标化合物。
结果与讨论
1 目标化合物的合成
目标化合物的结构经1H NMR、MS、元素分析及IR 得以确证, 理化数据。
2 乙酰胆碱酯酶体外抑制活性
为了进一步研究化合物的生物活性, 进行了AChE 体外抑制活性实验。测试结果表明, 制备的19个化合物中, 5 个具有生物活性 (表3)。化合物4d 对乙酰胆碱酯酶的抑制活性是最佳的, 其IC50 平均值达到了7.2 μmol·L1, 优于对照药利斯的明, 但没有石杉碱甲的活性好。通过化合物的结构对比发现, 5 个有活性的化合物有3 个酰基上的碳链为4 个亚甲基,并且活性最好的4d 也含有4 个亚甲基, 由此推测碳链比较长时, 活性较好。二级胺对化合物的活性也有显著的影响, 从化合物1a～4d 之间可以得出, 不同的含氮基团对化合物的活性有决定性的作用, 当R3是CH3N(CH2CH2)2N-时, 化合物才表现出最好活性。
3 丁酰胆碱酯酶体外抑制活性
胆碱酯酶是体内迅速水解乙酰胆碱的酶, 表面有两个活性中心, 既CAS 部位和PAS 部位。该酶有两种: 真性胆碱酯酶 (乙酰胆碱酯酶), 存在于胆碱能神经元内、胆碱能突触及红细胞内, 是水解内源性乙酰胆碱的必需酶; 假性胆碱酯酶 (丁酰胆碱酯酶),主要存在于血浆、肝脏及胶质细胞, 在终止内源性乙酰胆碱的作用上不起主要作用, 并且抑制BuChE, 会引起干细胞损伤。因此有必要对BuChE 的活性进行测定。选择对乙酰胆碱酯酶抑制活性的化合物做了相应的丁酰胆碱酯酶体外抑制活性实验, 并与对照药进行了比对, 5 个化合物中只有4d 对丁酰胆碱酯酶有抑制活性 (表4), 但对于丁酰胆碱酯酶抑制效果不佳, 因此选择性相对较好。
4 小结
合成的19 个化合物中化合物4d 对乙酰胆碱酯酶的生物活性最好, 其IC50 均值达到了7.2 μmol·L1,活性优于对照药物利斯的明但不如石杉碱甲。其对丁酰胆碱酯酶的抑制活性均值为1 200 μmol·L1, 说明4d 对乙酰胆碱酯酶抑制有很好的选择性。因此5-氨基苯并咪唑酮类衍生物对乙酰胆碱酯酶的活性值得进一步的研究。
实验部分
所有实验材料除另作说明外, 均为市售。乙酰胆碱 (电鳗) 购自Sigma 公司。用SGW X-4 显微熔点仪测定熔点 (上海精密科学仪器有限公司, 中国),温度未校正。1H NMR 由Bruker AVANCE 600 核磁共振仪 (DMSO-d6 为溶剂, TMS 做内标) 测定。质谱由Bruker apex ultra 7.0 T 傅里叶变换型质谱仪测定; 元素分析由Carlo Erba-1160 型元素分析仪测定; 红外光谱采用FTIR-8400S 傅里叶变换红外分光光度计。96 孔板读取用1420 Victor 酶标仪。
1 化合物合成
1.1 化合物1～4 的合成 (以化合物1 为例)
取0.1mol (14.9 g) 的5-氨基苯并咪唑酮、0.05 mol K2CO3(6.9 g) 和200 mL 的N, N-二甲基甲酰胺 (DMF) 置于500 mL 的反应瓶中, 室温搅拌, 然后滴加氯乙酰氯和DMF 的混合溶液, 混合溶液用等体积的氯乙酰氯 (0.11 mol) 和DMF 混合, 然后摇匀, 滴加完后反应10 min。反应结束后加入600 mL 水, 出现沉淀,静置半小时抽滤, 每次用50 mL 的水冲洗3 遍, 晾干称重得到9.5 g 浅灰色化合物1, 收率69%, 熔点303～305 ℃。1H NMR δ 10.57 (s, 1H, imidazole-H),10.52 (s, 1H, imidazole-H), 10.16 (s, 1H, -CONH-),7.44 (d, J = 1.7 Hz, 1H, ArH)), 7.01 (d, J = 1.9 Hz, 1H,ArH)), 6.86 (d, J = 8.3 Hz, 1H, ArH)), 4.21 (s, 2H,-CH2-); ESI-MS m/z 226.0 [M+H]+; C9H8N3O2(EA)Calcd. (%): C 48.00; H 3.56; N 18.67; Found (%): C47.91; H 3.57; N 18.62。同法制的化合物2～4。化合物2: 收率: 70%, 熔点299～301 ℃。1 H NMR δ 10.56 (s, 1H, imidazole-H),10.49 (s, 1H, imidazole-H), 9.92 (s, 1H, -CONH-), 7.47(s, 1H, ArH), 7.01 (d, J = 8.1 Hz, 1H, ArH), 6.84 (d,J = 8.2 Hz, 1H, ArH), 3.87 (t, J = 6.0 Hz, 2H, -CH2-),2.79 (t, J = 6.0 Hz, 2H, -CH2-); ESI-MS m/z 240.1[M+H]+; C10H10N3O2(EA) Calcd. (%): C 50.21; H 4.18;N 17.57; Found (%): C 50.12; H 4.21; N 17.53。化合物3 收率65%, 熔点290～292 ℃。1H NMRδ 10.53 (s, 1H, imidazole-H), 10.46 (s, 1H, imidazole-H), 9.85 (s, 1H, -CONH-), 7.46 (s, 1H, ArH), 7.05～7.00 (m, 1H, ArH), 6.82 (d, J = 8.3 Hz, 1H, ArH), 3.68(t, J = 6.5 Hz, 2H, -CH2-), 2.45 (t, J = 7.3 Hz, 2H,-CH2-), 2.06～1.99 (m, 2H, -CH2-); ESI-MS m/z 254.1[M+H]+; C11H12N3O2(EA) Calcd. (%): C 52.17; H 4.74;N 16.60; Found (%): C 52.08; H 4.77; N 16.56。化合物4 收率64%, 熔点298～299 ℃。1H NMRδ 10.52 (s, 1H, imidazole-H), 10.45 (s, 1H, imidazole-H), 9.74 (s, 1H, -CONH-), 7.46 (s, 1H, ArH), 7.00 (d,J = 8.1 Hz, 1H, ArH), 6.82 (d, J = 8.3 Hz, 1H, ArH),3.66 (t, J = 6.2 Hz, 2H, -CH2-), 2.31 (t, J = 7.0 Hz, 2H,-CH2-), 1.76 (dd, J = 13.5, 6.8 Hz, 2H, -CH2-), 1.71 (dd,J = 14.3, 7.1 Hz, 2H, -CH2-); ESI-MS m/z 268.1[M+H]+; C12H14N3O2(EA) Calcd. (%): C 53.93; H 5.24;N 15.73; Found (%): C 53.84; H 5.27; N 15.70。
1.2 化合物1a～2e 的合成 (以化合物1a 为例)
取0.5 g 化合物1 (2.2 mmol)、0.9 g 三乙胺 (8.8 mmol)、0.2 g 四氢吡咯 (2.5 mmol) 和3 mL DMF 置于反应试管中, 80 ℃反应8 h。反应结束后加入9 mL 水, 出沉淀, 静置12 h 后抽滤, 用5 mL 的水冲洗, 冲洗3遍, 确保DMF 除净, 晾干称重得到0.1 g 化合物1a,同法制的化合物1b～1f、2a～2e。
1.3 化合物3a～4d 的合成 (以化合物3a 为例)
取0.5 g 化合物3 (2 mmol)、0.8 g 三乙胺 (8 mmol)、0.16g 四氢吡咯 (2.2 mmol) 和3 mL DMF 置于反应试管中, 120 ℃反应8 h。反应结束后加入20 mL 二氯甲烷,出沉淀, 静止1 h 后抽滤, 每次用5 mL 的二氯甲烷冲洗, 冲洗3 遍, 除掉DMF, 然后用300 mL 甲醇溶解所得固体。减压蒸出溶剂, 剩余物经硅胶色谱柱 (洗脱剂为二氯甲烷与甲醇, 体积比6∶1) 分离纯化得到0.15 g 3a, 同法制的化合物3b～3d、4a～4d。
2 体外AChE 抑制实验
采用Ellman 分光光度法[20]在体外考察化合物对电鳗乙酰胆碱酶的抑制作用,设置空白组, 利斯的明、石杉碱甲为阳性对照组进行实验。配制Tris 缓冲液pH 为7.2, 底物ACTI (碘化硫代乙酰胆碱) 的浓度为0.6 mmol·L1, 显色剂DTNB 的浓度为3 mmol·L1,电鳗AChE 总量为0.035 U, 抑制剂的配置浓度分别为1×104、1×105、1×106、1×107、1×108 mol·L1。分别取20 μL Tris 缓冲液、10 μL 电鳗AChE、10μL 各浓度的抑制剂于96 孔板中, 37 ℃下保温12 min,然后加入10 μL 底物ACTI 和50 μL 的显色剂DTNB,5 min 后使用1420 Victor 多标计数仪在405 nm 处读取每孔吸光度。空白组用10 μL Tris 缓冲液分别代替底物和抑制剂, 标准组用10 μL Tris 缓冲液代替抑制剂, 每个化合物在不同浓度均实验2 次。然后以抑制率I [I = 100 × (A 测A 空) / (A 标A 空)%] 对抑制剂浓度C 作图, 进行S 型曲线线性拟合, 得到半数抑制率IC50 对应的浓度Cx, 为了得到准确的IC50, 然后从1×105～1×109 mol·L1 中选择最接近Cx 的浓度1×10x mol·L1, 且1×10x mol·L1 小于Cx。配制1×10x、3×10x、5×10x、7×10x、9×10x mol·L1, 同法操作酶抑制实验, 然后以抑制率I 对抑制剂浓度C作图, 进行直线线性拟合, 求出IC50。
3 体外BuChE 抑制实验
取5 mL 静脉人血, 室温静置1 h, 4 ℃放置2 h。用离心机2 000 r·min1 离心10 min, 取上清液, 即得丁酰胆碱酯酶酶液。其实验具体操作方法与乙酰胆碱酯酶酶活力测定方法相同, 将乙酰胆碱酯酶酶活力测定中的底物碘化硫代乙酰胆碱换成碘化硫代丁酰胆碱即可。
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