柱层析技术在中药材有效成分分离纯化中的应用

时间：2022-12-04 00:35:16 生物科学毕业论文我要投稿

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　　吸附柱层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使各组份分离的方法，以下是小编搜集整理的一篇探究柱层析在分离纯化有效成分中应用的论文范文，供大家阅读参考。

　　中药材中有效成分具有显著的生理活性和药理作用，其中以多糖、生物碱和黄酮等的应用最为广泛。但中药材有效成分复杂、含量低、杂质多，用常规提取法得到的提取物仍是混合物，需进一步分离与纯化。柱层析技术是利用物质的分子形状、大小、带电状态、溶解度、吸附能力、分配系数、分子极性及亲和力等理化性质的差别，使混合物中各组份以不同程度分布在固定相和流动相中，使各组份逐步分离。其优点是分离效率高，应用物质范围广、分离条件参数选择性强、操作条件温和等，广泛应用于多糖、生物碱、黄酮、酶、色素、苷类、萜类等代谢产物和生物大分子的分离纯化。本文重点介绍几种柱层析在中药材多糖、生物碱和黄酮的分离纯化中的应用，为中药研究开发提供参考。

　　1 柱层析的分类

　　根据物质分离机理的不同，目前的柱层析可分为吸附柱层析、离子交换柱层析、凝胶柱层析、亲和柱层析、疏水柱层析、分配柱层析及等电聚焦柱层析等多种类型。其中，吸附、离子交换、凝胶柱层析是应用最为广泛的柱层析技术[1]。

　　吸附柱层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使各组份分离的方法。吸附力越大的物质，移动速率越慢。常用的吸附剂有吸附树脂、硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭、硅藻土的。吸附柱层析主要应用在生物碱、色素等生物小分子物质的分离，其成本较低、易于操作，在天然药物分离制备中应用较广[2]。

　　离子交换柱层析是利用离子交换剂对各种离子的离子交换亲和力不同，将目标离子固定在固定相中，通过洗脱液洗脱而使各组份得以分离。常用的有离子交换树脂、离子交换纤维素(二乙胺基乙基纤维素等)、离子交换凝胶(二乙胺基乙基纤维素-葡聚糖凝胶等)。离子交换柱层析的优势是填充介质种类多、分离物质范围广、操作便利、分离效果好等，是目前最为广泛应用的层析技术，现已广泛应用于糖、酶、蛋白质、氨基酸、有机酸等物质的分离纯化[3]。

　　凝胶柱层析是基于物质分子大小不同而分离的方法。分子小的物质因进入凝胶网孔而移动较慢;分子量大的物质不能进入网孔，移动较快，从而先流出层析柱。常用的凝胶有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯胺凝胶等。其分离条件温和、回收率高、分离的分子质量范围广，常用于蛋白质、酶、多糖等生物大分子的分离纯化[3]。

　　2 柱层析在分离纯化有效成分中的应用

　　2.1 多糖

　　多糖是由单糖聚合形成的天然高分子化合物，是生物体内重要的生物大分子，具有抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、抗病毒、降血糖、降血脂等多种生物活性，其在医药、保健等方面用途广泛。目前，常用于多糖分离纯化的为离子交换柱层析、凝胶柱层析、吸附柱层析。在离子交换柱层析分离中药材多糖中，常用的固定相是离子交换纤维素和离子交换树脂。

　　李氏等[4]在红蘑多糖分离纯化中使用了二乙氨乙基(DEAE)纤维素离子交换柱层析，结果发现，用不同的洗脱液连续洗脱能收集到4个洗脱主峰，分别出现在0、0.1、0.3、1.0 mol/L的NaCl洗脱部分，而0.5、0.7、1.5、2.0 mol/L的NaCl洗脱部分则没有明显的洗脱峰。其纯化多糖的总量为上样量的71.2%。王氏等[5]利用阴离子交换树脂D315对茶多糖进行了分离，在pH值为6.0～7.0、温度30 ℃、上样量浓度2.5 mg/L条件下，通过水和0.5 mol/L的NaCl溶液洗脱，能提高茶多糖的纯度，并实现初步分离纯化。

　　扈氏等[6]利用凝胶柱层析技术对沙葱多糖进行纯化，其通过SephadexG-100凝胶柱层析，得到了分子量为5.89×104 g/mol的均一组份多糖。另有报道，在利用不同的大孔树脂分离纯化无花果和牛蒡子多糖时发现，AB-8树脂有较好的纯化效果[7-8]。

　　总之，不同柱层析均可应用在多糖的分离纯化中，有的研究将多种类型柱层析联合使用，以达到提高多糖纯度获得单体的目标。如李氏[9]通过离子交换层析和凝胶柱层析获得了分子量均一的山萸肉多糖。

　　2.2 生物碱

　　生物碱为一类显碱性的含氮有机化合物，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、保护心血管等作用。传统分离纯化生物碱的方法效率和纯度较低，而柱层析技术对生物碱有较好的分离纯化效果，其常用的柱层析有离子交换柱层析和吸附柱层析技术。

　　张氏等[10]利用ZB-2强碱性阴离子交换纤维柱层析分离纯化了指天椒中的辣椒碱，在实验最优条件下，将辣椒碱的含量由4.5%提高到92.0%，回收率为72.3%。迟氏等[11]研究表明，强酸性阳离子交换树脂DOWEX 50WX2也能应用于角蒿生物碱的分离纯化。翟氏等[12]利用硅胶柱层析，分离纯化了平贝母的总生物碱。其以薄层层析硅胶G为固定相，乙酸乙酯-甲醇-氨水(17∶2∶1)为流动相，分离得到了贝母素甲和贝母素乙，其纯度分别达到93.19%和92.09%。另外，大孔吸附树脂D101也应用在荷叶生物碱的分离纯化中，其效果强于聚酰胺和HP-20大孔树脂[13]。潘氏等[14]研究显示，采用AB-8型吸附树脂和硅胶柱层析得到了纯度为97.26%和94.18%的长春碱和长春新碱。

　　2.3 黄酮

　　总黄酮是黄酮类化合物的总称，泛指2个具有酚羟基的苯环(A-环与B-环)通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，包括黄酮、黄酮醇双氢黄(醇)、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等，是一类很强的抗氧化剂，能够抗癌、防癌、抑菌、抗病毒、保护心血管系统、调节免疫系统功能等[15]。目前分离黄酮类物质常采用离子交换柱层析和吸附柱层析。　　肖氏等[16]利用强碱阴离子交换树脂对大豆异黄酮进行了有效的分离纯化。董氏等[17]利用强碱性阴离子交换纤维对银杏叶黄酮的分离纯化进行了参数优化研究。两者研究均发现，在强碱性溶液中，黄酮在层析柱中的吸附效果佳，而强酸性洗脱液洗脱效果好。同样是银杏叶黄酮，傅氏等[18]则利用大孔吸附树脂进行纯化，可获得总黄酮达34.3%的产物。程氏等[19]采用FL-1大孔树脂柱层析，得到纯度为55.22%的番石榴叶总黄酮。而瘤果黑种草子总黄酮提取物经过AB-8大孔树脂和聚酰胺柱层析2次纯化后，总黄酮的纯度为62.2%，且产品回收率高[20]。蒋氏等[21]比较了3种方法在分离纯化木姜叶柯总黄酮中的效果，发现聚酰胺树脂法得到的黄酮含量为70.67%，远高于溶剂萃取法(37.84%)和大孔吸附树脂法(48.64%);进一步研究还发现，80～100目的聚酰胺树脂的吸附量和洗脱率均较高。

　　3 结语

　　柱层析技术是目前较为先进的分离纯化技术，具有回收率和纯度高、能源消耗和环境污染低等优点，在中药材有效成分的分离纯化方面有广阔的应用前景。对不同中药材和不同有效成分，甚至同一中药材的同一成分，所使用的柱层析技术也呈现出多样化。这不仅体现在柱层析的类型、固定相、流动相的选择，还体现在上样液、上样浓度、洗脱液、流速、温度等技术参数，以及多种层析柱的联合使用上。在实际使用中，应根据特定中药材和有效成分，以及产品的质量要求，优化分离纯化生产工艺技术。

　　参考文献：

　　[1] 王妍，张兴义.几种柱层析的特点和在纯化工艺中的选择[J].中国生物制品学杂志，1999，12(3)：187-191.

　　[2] 周剑，丁玉峰.大孔吸附树脂分离中草药有效成分的应用[J].中国医院药学杂志，2006，26(1)：69-71.

　　[3] 杨昌鹏，张爱华.生物分离技术[M].北京：中国农业出版社，2007：136-147.

　　[4] 李书倩，辛广，张博.红蘑多糖的纤维柱层析分离纯化[J].食品科技， 2012，37(12)：170-173.

　　[5] 王元凤，金征宇.D315树脂分离茶多糖工艺的研究[J].农业工程学报， 2005，21(10)：147-150.

　　[6] 扈瑞平，杜玲，敖长金，等.沙葱多糖的SephadexG-100凝胶柱纯化和分子量的测定[J].科学技术与工程，2011，11(12)：2780-2783.

　　[7] 陈运江.大孔径树脂分离纯化无花果多糖工艺研究[J].江苏农业科学， 2010，38(2)：320-321.

　　[8] 季志红，阻力皮亚・艾山，周晓英.大孔吸附树脂分离纯化毛头牛蒡子多糖的工艺研究[J].环球中医药，2013，6(2)：81-83.

　　[9] 李平.山萸肉多糖化学、生物活性及树脂吸附法分离植物有效成分研究[D].北京：北京化工大学，2005.

　　[10] 张阳，王立升，周永红，等.离子交换纤维柱分离纯化辣椒碱类化合物[J].精细化工，2011，28(2)：130-134，176.

　　[11] 迟玉明，吉泽丰吉，等.离子交换树脂用于角蒿总生物碱的纯化研究[J].天然产物研究与开发，2005，17(5)：88-92.