评价布氏菌活疫苗的免疫原性和免疫保护效果

时间:2020-09-29 15:52:35 生物科学毕业论文 我要投稿

评价布氏菌活疫苗的免疫原性和免疫保护效果

  布氏疫苗主要包括灭活苗、减毒活疫苗、菌体组分疫苗以及现在热门研究的基因疫苗和重组蛋白疫苗等,下面是小编搜集整理的一篇探究布氏菌活疫苗的免疫原性和免疫保护效果的论文范文,欢迎阅读参考。

  布氏菌病(Brucellosis,简称布病)是布氏菌引起的能够在人和动物中传播的一类人兽共患病。布氏菌具有侵袭力强、传染途径多、引起多器官损伤的特点。家畜感染后如果得不到良好的治疗可引发母畜流产和不育,人感染则主要引起波浪热和转化为慢性感染。据调查,全球已有170多个国家和地区有布病发生和流行。而我国28个省市区的人、畜有布病存在和流行,每年造成近千万元损失。

  疫苗接种是防治布病最有效、最经济的手段。目前,我国采用的人用布氏菌活疫苗为牛种弱毒株104M菌株,接种方式为皮上划痕。该方法操作复杂、不能定量接种,人群接种阳转率低,保护效果有限,被接种者因划痕产生疼痛而不易被接受,从而影响疫苗的广泛使用。鉴于布病疫情控制的需要,我们采用具有经济性好和安全性高的皮内注射接种方式替代传统的皮上划痕。本次研究以小鼠为动物模型,采用皮内注射方式免疫,从体液免疫、细胞免疫和保护力试验三个方面的结果全面评价疫苗的免疫原性和免疫保护效果。

  1、材料与方法

  1.1主要材料

  1.1.1动物SPF级BALB/c小鼠,6~8周,白色雌性,共30只,由中国食品药品检定研究院(简称中检院)实验动物中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2009-0017,饲养于中检院清洁级动物室。

  1.1.2菌种皮下注射用布氏菌活疫苗及羊布氏菌M5弱毒株均由中检院结核病疫苗室提供。

  1.1.3实验仪器Bio-II-A生物安全柜购自西班牙Telstar公司;Dragon-MK3酶标仪购自芬兰Labsystems公司;DH6000AB型恒温培养箱购自天津市泰斯特仪器公司;高速离心机购自德国Eppendorf公司;酶联斑点分析仪购于美国CTL公司;CO2培养箱购于美国Napco公司;加样枪购于Gilson公司。

  1.1.4试剂耗材牛血清白蛋白和ConA购自美国Sigma公司;小鼠IFN-γ酶联免疫试剂盒购自美国BD公司;达优-淋巴细胞分离液、无血清培养基、IFN-γ及IL-4ELISA预包被试剂盒均购自达科为生物技术公司;碱性磷酸酶标记羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a购自美国Bethyl公司;pNPP底物显色液购自美国SurModics公司。

  1.2方法

  1.2.1动物分组及免疫将30只BALB/c小鼠随机分成3组,每组10只,分别为低剂量组(5×107/只),高剂量组(2×108/只),生理盐水对照组,3组均为后肢皮下注射,剂量为0.2ml/只。

  1.2.2动物血清和脾脏淋巴细胞的制备免疫4周后,对每只小鼠进行摘眼球取血,分离血清,–20℃保存,用于ELISA体液免疫检测。将每只动物无菌取出的脾脏放在筛网上,滴加淋巴细胞分离液研磨,研磨液用巴氏管吸入到15ml离心管中,滴加200~500μl达优无血清培养基进行低速梯度离心,在25℃条件下,800×g离心30min,吸出淋巴细胞层,加入10ml无血清培养基,颠倒洗涤,室温、250×g离心收集细胞,用于ELISPOT细胞免疫的检测。

  1.2.3体液免疫检测

  1.2.3.1抗菌体抗原总IgG抗体水平检测用间接ELISA法检测小鼠血清IgG的效价。以灭活布氏菌体5×108/ml的浓度包被96孔酶标板,4℃过夜;以TBS-T300μl洗板5次,用1%的BSA封闭(200μl/孔),37℃静置1h;每孔加入100μl的50×开始倍比稀释的待检血清,37℃静置1h;按1:1000倍稀释碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG,洗板后100μl/孔加入,37℃静置1h;洗板,加入100μl/孔的pNPP底物显色液,室温避光30min后加入100μl/孔终止液(3mol/LNaOH)终止反应;在波长为405nm处检测吸光值A405。

  1.2.3.2抗菌体抗原IgG抗体亚类检测以灭活布氏菌体5×108/ml的浓度包被96孔酶标板,小鼠免疫4周后血清为一抗,碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG1、IgG2a为二抗,其余操作步骤同1.2.3.1。

  1.2.4细胞免疫检测

  1.2.4.1分泌IFN-γ、IL-4的脾脏淋巴细胞的数目检测小鼠免疫4周后,分离小鼠脾脏淋巴细胞,取96孔细胞培养板,每孔中加混有2.0×106个/ml浓度细胞100μl,每孔分别加入100μl布氏PPD抗原(终浓度为5μg/ml和10μg/ml)和灭活菌体抗原(终浓度为1×108/ml和1×107/ml)。每种抗原刺激物做复孔,另用细胞培养液作阴性对照,一孔加ConA作阳性对照(终浓度为5μg/ml)。共同孵育16h后,按ELISPOT操作依次加入检测抗体等试剂,洗板,显色,计数斑点数。

  1.2.4.2体外再刺激免疫小鼠脾细胞因子产生水平检测取48孔细胞培养板,每孔中加2.0×106个/ml浓度细胞400μl,每孔分别加入50μl布氏PPD抗原(终浓度为5μg/ml和10μg/ml)和灭活菌体抗原(终浓度为1×108/ml和1×107/ml)。分别以ConA(终浓度为5μg/ml)和培养基为阳性和阴性对照。37℃,5%CO2培养箱中孵育18h,孵育完毕对培养物进行离心,取各孔细胞培养液上清,用小鼠IFN-γ、IL-4ELISA试剂盒检测体外不同刺激物刺激小鼠脾细胞分泌IFN-γ、IL-4的情况。

  1.2.5布氏菌活苗保护力检测在小鼠免疫4周后,各组取5只小鼠,对每只小鼠皮下攻击羊种布氏菌M5弱毒株,攻击剂量为5×108cfu/只,4周后无菌取脾脏,通过脾脏细菌计数评价布氏活苗的免疫保护作用。

  1.3统计学处理

  实验数据以x±s表示,各组动物的效价取以10为底的对数后进行t检验;用GraphPadPrism6绘图及SPSS统计软件分析,结果以P<0.05表示差异有统计学意义。

  2、结果

  2.1小鼠血清中抗菌体抗原总IgG水平测定。

  小鼠血清用间接ELISA方法测抗体水平,结果显示,阴性组小鼠检测不到特异性抗体,低剂量组和高剂量组小鼠均可检测出,但低剂量组抗体水平略高于高剂量组,经统计学分析两者差异无统计学意义(t=1.890,P=0.095>0.05,n=10),结果见图1。

  2.2抗菌体抗原抗体亚类测定

  抗体亚类分析结果显示免疫组小鼠均产生特异性IgG1、IgG2a抗体,两者的水平相近,结果见图2。

  2.3ELISOPT结果

  将已形成斑点的96孔板终止反应,自然风干过夜后上机计数并拍照,对每孔内的斑点进行质控。最终斑点计数显示低剂量组和高剂量组在不同浓度的PPD和灭活菌体抗原刺激下分泌IFN-γ、IL-4的脾脏淋巴细胞数明显多于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05),结果见图3、4。

  2.4体外再刺激免疫小鼠脾细胞因子检测结果

  利用ELISA方法检测以PPD抗原(5μg/ml,10μg/ml)和灭活菌体抗原(1×108/ml,1×107/ml)体外刺激小鼠脾细胞分泌IFN-γ、IL-4水平。结果显示,在不同浓度PPD和灭活菌体抗原刺激下分泌的IFN-γ的含量明显高于阴性组,差异有统计学意义(P<0.05),结果见图5。IL-4含量很低,达不到标准曲线的检测限,结果没有统计学意义。

  2.5布氏菌活苗免疫保护力结果

  为评价布氏菌活疫苗的保护力,用羊布氏菌M5弱毒株皮下攻击免疫动物,以脾脏布氏菌分离数为指标,评价保护力,结果见图6。低剂量免疫组小鼠脾脏的细菌载量与阴性对照组比较有显著性差异(t=4.406,P<0.05,n=9),高剂量免疫组小鼠脾脏的细菌载量与阴性对照组比较有显著性差异(t=3.842,P<0.05,n=8)。说明小鼠免疫布氏菌活苗获得很好的免疫保护。

  3、讨论

  机体对布氏菌的清除依赖于体液免疫和细胞免疫的'联合作用。体液免疫产生的抗体在细胞外能够阻断布氏菌与宿主细胞间相互作用,并将其包裹起来抑制菌体释放内毒素;在胞内阻止细菌在宿主细胞内的复制繁殖。本试验以低、高剂量免疫布氏活疫苗,检测免疫4周后血清抗体,结果显示,低剂量组和高剂量组小鼠可检测到高滴度特异性抗体,低、高剂量组IgG效价几何均数分别为459、229。由此可见,产生特异性抗体滴度比较低,说明体液免疫水平相对较弱。抗体亚类分析结果显示免疫组小鼠均产生特异性IgG1、IgG2a抗体,两者抗体水平相近。

  布氏菌是胞内寄生菌,细胞免疫对杀灭布氏菌起关键作用。布氏菌感染宿主后被APC提呈给吞噬细胞,同时激发APC分泌IL-12、IL-4细胞因子,引起Th0细胞(CD4+)分别分化Th1和Th2细胞。Th1细胞分泌IFN-γ激活吞噬细胞的吞噬功能,参与细胞免疫;Th2细胞分泌IL-4细胞因子主要参与体液免疫。本研究,分别用ELISOPT和ELISA方法对不同浓度的PPD和灭活菌体抗原刺激下分泌IFN-γ和IL-4脾淋巴细胞数目和含量进行检测。ELISOPT结果显示,与阴性组比较,实验组在不同浓度的两种刺激物下分泌IFN-γ、IL-4脾淋巴细胞数目均有统计学差异;ELISA结果显示,与阴性组比较,实验组在不同浓度的两种刺激物体外刺激分泌IFN-γ含量有显著差异,IL-4含量很低。实验结果充分说明布氏菌疫苗免疫小鼠诱导(CD4+)向Th1细胞的分化,机体主要以细胞免疫为主。

  疫苗的效力测定实验是评价疫苗免疫保护性最可靠指标。传统对布氏疫苗的研究主要是使用豚鼠,效力实验用强毒株攻击,本次研究参照《中国药典》效力测定的方法,以小鼠为动物模型,羊布氏菌M5弱毒株攻击,大大提高了实验的经济性和安全性。试验结果显示,免疫组小鼠脾脏的细菌载量与阴性对照组比较有显著性差异,说明小鼠皮下免疫布氏菌活疫苗获得很好的保护效果。另外,由于小鼠皮上划痕不易操作,无法加入传统的划痕疫苗对照,该比较研究将进一步以豚鼠为模型进行探索。

  本次试验是对皮下免疫效果的初步研究,试验表明,布氏疫苗采用皮下免疫途径是可行的,免疫后能获得很好的免疫原性,注射用布氏活苗有希望代替皮上划痕用疫苗,不但接种方式简单,而且接种剂量更低,但能否真正取代传统划痕疫苗,还有待强毒布氏菌攻击保护试验和临床试验进一步研究

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