杆菌肽在水产品中残留量测定的微生物方法
杆菌肽目前没有纯品，需检测的标示物组分多，色谱和质谱不能准确地确定其全部残留标示物，需要采用微生物法来测定其残留情况，下面是小编为大家搜集整理的一篇相关论文范文，欢迎阅读参考。
杆菌肽最早于1943年由美国哥伦比亚大学的Johnson从患者的胫骨创伤污染物中分离出的枯草杆菌(Bacillμs sabtilis)中发现的[1].它是一种多组分的多肽类抗生素，含有至少5种单独的化学成分，主要成分为杆菌肽A和杆菌肽B,对革兰氏阳性菌的抗菌作用很强，对于螺旋体、放线菌也有同样作用[2].
目前杆菌肽(锌杆菌肽和亚甲基水杨酸杆菌肽)在很多动物中常作为饲料添加剂使用[3-5],研究发现饲料中添加抗菌肽对吉富罗非鱼具有明显的促生长效果[6].抗菌肽还对水产养殖过程中常见病原菌-嗜水气单胞菌、梅氏弧菌、迟钝爱德华氏菌及温和气单胞菌均有较好的抑菌效果[7].但是如果使用得不科学，将导致药物在水产品中残留情况严重，对动物性食品安全带来隐患，因此，需要有效的检测方法来检测其残留量。目前动物性食品或者饲料中杆菌肽残留量的测定方法主要有微生物法[8-9]、液相色谱法或色谱质谱联用法[10-13].因为杆菌肽目前没有纯品，需检测的标示物组分多，色谱和质谱不能准确地确定其全部残留标示物，加上需反映出不同活性组分生物活性的差异，所以采用微生物法来测定其残留情况。本研究拟建立一种杆菌肽在水产品可食性组织中残留量测定的微生物方法，监测水产品可食性组织中杆菌肽的残留量，以保证我国水产品中杆菌肽残留达到安全限量。
1材料与方法
1.1材料
1)仪器与器皿。恒温培养箱(DN0-9162BS-Ⅲ,新苗医疗器械公司)、超净工作台(Type A2,LA-BONCO)、压力蒸汽灭菌锅(BL-50A,博讯实业有限公司)、高速冷冻离心机(CR-21,himac)、旋转蒸发仪(TRE2000E,予华仪器有限责任公司)、旋涡混合器(HQ-60-Ⅱ,北方同正)、振荡器(SHZ-82,科兴仪器厂)、超声波清洗器(SK2210HP,上海科导)、电子天平(MP2002,舜宇恒平科学仪器有限公司)，不锈钢牛津杯(高(10.0±0.1)mm,外径(8.0±0.1)mm,内径(6.0±0.1)mm)、游标卡尺(精确度0.02mm)、一次性培养皿(15mm×90mm)等。
2)药物与试剂。杆菌肽标准品(含量76.0%,Dr.Ehrenstorfera)、其他药物(硫酸链霉素、盐酸土霉素、恩诺沙星、磺胺二甲嘧啶、氨卡青霉素、替米考星、乙酰甲喹、甲砜霉素)均为标准品，甲醇、甲酸、正己烷均为分析纯，蒸馏水，1%pH 6.0磷酸盐缓冲液(PBS)：磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g,加水定容至1 000mL,灭菌。
3)细菌与培养基。藤黄微球菌CMCC(B)28001-8a3、大肠杆菌CMCC(B)44109-9、枯草芽胞杆菌CMCC 63501-2a16均购自中国兽药监察所，抗生素检定培养基Ⅱ号(低pH)、LB琼脂培养基、LB培养基均购自海博生物技术有限公司。
4)空白水产样品。草鱼、鳗鲡和对虾购自本地水产品市场，检测均无任何药物残留。
1.2方法
1)标准溶液配制。准确称取0.010 0g(精确至0.000 1g)杆菌肽标准品，用PBS溶解并定容至100mL,制得100mg/L的标准储备液，4℃避光储存，不超过1个月。根据需要稀释成不同质量浓度的标准工作液，即用即配。
2)菌种培养及菌液制备。选用藤黄微球菌为检测菌种。将灭过菌的LB培养基加入菌种安瓿瓶，溶解后，取少量到LB培养基中，混匀，(36±1)℃培养24h,之后转接至斜面培养基，培养16~18h,挑取少量菌落到LB培养基中，再培养24h,接种于LB琼脂平皿中，培养24h,用生理盐水洗下，调整至6×108cfu/mL(麦氏浊度2.0)备用。4℃保存不超过1周。
3)检定平板的制备。冷却灭过菌的抗生素检定培养基Ⅱ号至50~55℃,加适量检测菌液，混匀，取5mL至培养皿内，凝固。用1μg/mL杆菌肽标准工作液预测试该菌液浓度的平板，如果培养后所呈现的抑菌圈直径大于10mm,则该菌液浓度下的平板可使用，否则需重新调整菌液浓度，再制成能有效检定药物的平板。
4)空白组织液制备。称取10g空白匀浆好的水产品肌肉组织于50mL离心管中，加20mLPBS,置于振荡器中中速振荡30min,超声10min,8000r/min离心5min,分离的上清液用1mol/LNaOH调节pH至6.0后，用0.22μm针头式滤器除菌备用。
5)标准曲线的绘制。吸取一定量杆菌肽标准储备液，用PBS稀释成1、2、4、6、8、10μg/mL系列质量浓度，准备制作标准曲线。其中参考溶液为4μg/mL的稀释液。同时用各水产品空白组织提取液来稀释杆菌肽标准储备液，得到1、2、4、6、8、10μg/mL系列质量浓度，制作杆菌肽在各基质中的标准曲线，参考溶液为4μg/mL PBS稀释成的稀释液。以上稀释液均当日配制。放置6个牛津杯于检定平板上，间隔加满参考溶液和标准溶液。
4℃放置1h后于(36±1)℃培养10~12h,去掉牛津杯，精确测量各药物所产生的抑菌圈直径(精确到0.02mm)，最后用全部参考溶液抑菌圈直径的平均值减去各平板参考溶液抑菌圈直径平均值的差值，作为各自平板的校正值，校正其他标准溶液抑菌圈直径的平均值。以上各组溶液质量浓度的对数与该组被修正后的抑菌圈数值做标准曲线，求出回归方程。相关系数r应不小于0.99.重复测定5次。
6)样品前处理。准确称取匀浆好的肌肉试样4g,加入提取液(甲醇和0.1%甲酸水溶液体积比为3∶7)10mL,涡旋30s,60℃加热5min,超声5min,8 000r/min离心5min,取上清液于另一离心管。重复提取1次，合并上清液，加入15mL甲醇饱和正己烷，涡旋30s,6 000r/min离心5min,弃去上层，重复1次。所得样液于50℃旋蒸至干。加入1mL PBS复溶，过0.22μm滤膜，供检测。浓缩后样液浓度为组织浓度的4倍。
7)药物最低检测限的测定。称取4g空白匀浆好的肌肉组织(草鱼、鳗鲡、对虾)，每种肌肉各4份，分别加入杆菌肽0.5、1.0、1.5、2.0μg,得到0.125、0.250、0.375、0.500μg/g 4个药物添加量的试验组，按样品前处理方法进行样品前处理，同时作空白对照，最后杯碟法测定。每个质量浓度重复测定3次。结果以产生明显抑菌圈(一般抑菌圈直径大于10mm,并且标准液参考质量浓度抑菌圈清晰可见)的最低质量浓度为药物在组织内的最低检测限。
8)药物回收率的测定。称取3份4g空白匀浆好的肌肉组织，分别加入杆菌肽2、6、10μg,使药物在各组织样品中的添加量分别为0.5、1.5、2.5μg/g.经样品前处理方法处理后，样液质量浓度为2、6、10μg/mL,同时杯碟法测定对应质量浓度的杆菌肽标准液(2、6、10μg/mL)。每个质量浓度重复3次。对照标准曲线，计算出各个样品在处理后的质量浓度和相对应的标准液的质量浓度，其比值为杆菌肽的绝对回收率。
9)杆菌肽的特异性测定。同时制备3种细菌藤黄微球菌、大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的检测平板，平板制作方法同藤黄微球菌。使用制作的3种细菌检测平皿分别单一检测多肽类药物杆菌肽和其他类常用水产药物的抑菌效果。重复3次。
10)杯碟法测定。定量检测，置6个牛津杯于检测平板内，间隔加入样液和4μg/mL杆菌肽标准液，(36±1)℃培养(10±2)h;定性检测，置4个牛津杯于检测平板内，对角加样液，余下2个牛津杯分别加2μg/mL和4μg/mL杆菌肽标准液，同时参照杆菌肽的特异性测定结果。每个样品3个平行。培养后测定抑菌圈大小，参考标准曲线，计算药物质量浓度。
2结果与分析
2.1杆菌肽的标准曲线
杆菌肽稀释液质量浓度的对数与抑菌圈直径呈线性关系。以杆菌肽稀释液质量浓度的对数作为横坐标，以抑菌圈直径作为纵坐标，得到杆菌肽在各基质中的标准曲线和相关系数。其中杆菌肽在1~10μg/mL内，标准曲线的线性关系良好，R2均大于0.990 0,在PBS中标准曲线回归方程为y=0.1018x-1.3784;在草鱼肌肉中标准曲线回归方程为y=0.0883x-0.8608;在鳗鲡肌肉中标准曲线回归方程为y=0.09x-0.7644;在对虾肌肉中标准曲线回归方程为y=0.1061x-1.2695.图1为标准曲线中各标准质量浓度在一个检测平板内的抑菌圈情况。
2.2杆菌肽的最低检测限
表1为各组织添加药物量分别为0.125、0.250、0.375、0.500μg/g下的抑菌圈直径，其中草鱼肌肉中添加量为0.250μg/g时可见清晰抑菌圈，直径(11.69±0.60)mm,对虾和鳗鲡肌肉中添加量为0.500μg/g可见清晰抑菌圈，直径分别为(10.60±0.60)mm和(10.17±0.73)mm,空白样品及添加量为0.125μg/g的各样品均未见抑菌圈(直径小于10mm)。相比于空白样品存在显着性差异。因此，草鱼肌肉中最低检测限为250μg/kg,对虾和鳗鲡肌肉中最低检测限为500μg/kg.
2.3杆菌肽的'添加回收率
杆菌肽在水产品可食性组织中添加回收率及其变异系数见表2.重复测定3次，不同水产品肌肉组织添加量在0.5~2.5μg/g时，草鱼肌肉回收率为86.82%~92.56%,变异系数为2.32%~10.77%;对虾肌肉回收率为81.61%~92.17%,变异系数为2.02%~11.80%;鳗鲡肌肉回收率为70.45%~93.44%,变异系数为4.48%~12.62%.各组织的回收率均在标准要求的范围(70%~120%)。变异系数均小于15%,符合该方法的检测要求。
2.4杆菌肽的特异性不同类别药物对3种细菌的抑菌效果测定结果见表3.在一定范围内，只对藤黄微球菌敏感的药物是杆菌肽，而其他药物或者对藤黄微球菌不敏感，或者对大肠杆菌和枯草芽胞杆菌敏感。利用不同药物在3种细菌检测平板中的抑菌效果可以排除所检测的药物是否为杆菌肽。
3讨论
杆菌肽抗菌谱广，目前被广泛应用于饲料添加剂预防和治疗疾病，但是由于使用不科学，药物在产品中残留很多，食用后给人体健康带来严重影响。
欧盟规定了杆菌肽残留检测物为杆菌肽A、B和C3种组分之和，牛奶中杆菌肽的残留限量为100μg/kg.中国和美国均规定，动物性食品猪、牛和牛奶、禽和禽蛋等可食组织中杆菌肽的最高残留限量为500μg/kg,残留检测的标示物为杆菌肽A、B和C三者之和[14].在测定杆菌肽残留量的方法中，色谱和液质联用技术虽然检测结果比较准确，但检测药物必须准确知道药物的组分及其分子结构，而杆菌肽的提取纯化目前还很难做到，各批次的药物组分有一定的差别，所以难以应用该方法进行残留量检测。且色谱和液质联用技术仅测定了杆菌肽A或者B,且前处理复杂，仪器昂贵，对另几种含量较少的组分均未测定[9-11,13].相较于其他方法，微生物法则是一种经典的抗菌药物残留检测方法[15-16],操作简单，不需要昂贵的仪器，适合生产应用，且能够有效检测到这一类药物(具有生物活性的多肽类)残留的每种组分的活性总量。所以微生物学测定动物性食品中杆菌肽残留的方法仍被广泛应用[8-9,15].
根据药物对某些特异微生物的杀灭或抑制效果，来定量或定性确定样品中残留的药物，方法科学有效。
在对检测菌种的筛选上，通过比浊法和杯碟法研究了藤黄微球菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌3种菌对杆菌肽的敏感性，最后发现藤黄微球菌对杆菌肽最敏感。与此同时，利用药物对不同细菌具有不同的敏感性的特性，用其他微生物制作的多平板法检测[17],确定了单一组分的残留物为杆菌肽。中国兽药典中有抗菌药物的微生物检定试验，其中试验设计表规定藤黄微球菌(CMCC28001)在pH值为6.5~6.6的培养基中，对杆菌肽、金霉素、多西环素等抗菌药物的灵敏度最高。而枯草芽胞杆菌(CM-CC 63501)在pH值为7.8~8.0培养基内，对盐霉素和吉他霉素等抗菌药物的灵敏度最高[18].本试验在一定浓度下，杆菌肽对藤黄微球菌最敏感，其他细菌不敏感。而其他药物也具有类似敏感细菌的情况。通过筛选，确定了藤黄微球菌、大肠杆菌和枯草芽胞杆菌这3种细菌的不同组合。参照不同药物对3种细菌的抑菌情况，分析不同药物对不同细菌能否产生有效抑菌圈(10~25mm)，发现制作的三检定平板可以有效鉴定出单一残留物是否为杆菌肽。
在对3种基质的标准曲线和PBS的标准曲线的比较中发现，每种肌肉对杆菌肽的抑菌效果都有不同的影响，影响由大到小依次为鳗鲡、草鱼、对虾。由3种基质的营养成分可以发现，鳗鲡的粗脂肪含量最高，草鱼、对虾很低，这与杆菌肽的在各基质中的回收率也相吻合，可见不同肌肉中脂肪含量的高低会影响药物残留的检测结果，脂肪含量越高，检测回收越困难。
测定杆菌肽在动物性组织中的残留情况，其中样品前处理的方法很重要。目前，常用于生物样品中提取杆菌肽残留的提取溶剂很多，如甲醇/甲酸[13,19]、乙腈/三氯乙酸[12]、甲醇/偏磷酸[20]等。其中我国曾颁布的出口禽肉中杆菌肽残留量检验方法中，采用了吡啶来提取冻鸡肌肉组织中杆菌肽的残留[8].本研究比较上述提取溶剂的提取效果，发现甲醇/甲酸水提取效果较好。通过对甲醇、乙腈和丙酮3种单一提取剂在水产品各肌肉组织中杆菌肽残留的研究，发现丙酮提取效果优于其他2种。但丙酮在提取后溶液含水和杂质多，氮吹浓缩中需要时间过长，最终选择甲醇/甲酸水溶液，通过旋蒸浓缩，效果理想。提取后经正己烷脱脂，可去除大部分杂质，药物复溶后过0.22μm滤膜，终试液澄清，抑菌圈清晰。
最终结果显示，杆菌肽在各肌肉组织空白提取液1~10μg/mL范围内，药物质量浓度对数与抑菌圈的直径线性关系良好(R2>0.990 0)，平均回收率70.45%~93.44%,变异系数2.02%~12.62%.
测定低限草鱼肌肉为0.25μg/g,对虾和鳗鲡肌肉为0.50μg/g,总体达到或低于我国农业部颁布的残留限量的国家标准。杆菌肽残留物还可以通过三细菌检定平板确定。因此，本试验建立的对水产品可食性组织中杆菌肽残留量检测的微生物方法是可行的，能够满足我国水产品可食性组织(肌肉)中杆菌肽残留量检测的要求。
参考文献：
[1] 程美玲，高士争.几种新型安全抗生素类饲料添加剂[J].饲料世界，2001(10):4-6.
[2] 陈杖榴.兽医药理学[M].3版.北京：中国农业出版社，2010:261.
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