灵芝菌糠悬浊液培养粉状毕赤酵母研究
摘 要：通过混合因子设计，以粉状毕赤酵母最大生物量为参照，比较了在以灵芝菌糠悬浊液为主要成分的液体培养基中，菌糠浓度、菌糠处理方式、玉米粉添加量三者对粉状毕赤酵母生长的影响，初步考察了经膨化处理的菌糠和未经处理的菌糠之间的区别，得到了经优化的灵芝菌糠悬浊液培养基，其最优配方为膨化灵芝菌糠0.100 g・mL-1，玉米粉0.010 g・mL-1，经由52 h培养后，粉状毕赤酵母的最大生物量为4.527×1010 CFU・mL-1。
关键词：菌糠;培养基;膨化;毕赤酵母
在食用菌栽培生产过程中，产生了大量含有菌丝体的培养基质，在栽培结束后，这种被称为菌糠(Waste medium of fungi culture，WMFC)的培养基废料的处理问题一直是食用菌栽培中的重要问题，尤其在近年来我国食用菌栽培的规模已经十分可观的情况下，产生的废弃菌糠以万t计[1]。食用菌菌糠中含有大量来自于所栽培食用菌菌丝体的多糖和菌体蛋白，以及尚未利用的培养基成分，营养价值上超越了作物秸秆，甚至于和麸类[2-3]以及玉米粉[4]相当。因此，将食用菌菌糠作为微生物发酵培养基的主要成分，拓展工业微生物培养基的原料来源，在实际生产上具有重要的意义。
由于菌糠来源于食用菌栽培培养基，大部分营养成分已经被食用菌所利用，或转化成菌丝成分，或转化为具有化感作用的代谢产物，使得菌糠对于同种或异种食用菌菌丝体有明显的抑制作用[5-6]。其中，大部分为食用菌的细胞壁成分，为结构复杂的杂多糖类物质[7]。因此，通过挤压膨化处理这种物理手段，对其菌糠进行预加工，以期改变原有的糖类、纤维类物质的组成，并去除化感物质，不失为一种廉价而有效的处理废弃菌糠的方法。
因此，本研究以灵芝菌糠以及膨化处理后的灵芝菌糠作为发酵培养基原料，进行培养毕赤酵母的初步研究，为食用菌菌糠的新的利用方式提供理论依据，并验证膨化处理方式在食用菌菌糠处理方面的可行性。
1 材料和方法
1.1 菌 种
粉状毕赤酵母Pichia farinosa，编号FL7，引自天津大学化工学院，分离自天津市林业果树研究所实验基地所采集的食用菌菌糠废弃物堆肥，使用0.5 mL YEPD液体培养基[8-9]分装于1 mL聚丙烯离心管中于4 °C冰箱保藏。
1.2 原料及处理
菌糠悬浊液培养基的制备采用以下2种经过不同处理的灵芝菌糠。
普通灵芝菌糠：取赤芝Ganoderma lucidum栽培结束，子实体已采收后所余含有菌丝体及剩余培养基之菌糠，经粉碎机粉碎后，过孔径为0.25 mm的筛，80 °C烘干至恒质量备用。
膨化灵芝菌糠：将普通灵芝菌糠经双螺杆挤压机膨化处理后[10]，冷却并粉碎，过孔径为0.25 mm的筛，80 °C烘干至恒质量备用。
玉米粉：取超市所售玉米粉过孔径为0.25 mm的筛，80 °C烘干至恒质量备用。
1.3 培养基
(1)种子培养基。采用YEPD液体培养基作为酵母种子培养基，具体配方如下：蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蒸馏水1 000 mL，pH值 6.0。将上述成分分别溶解于蒸馏水中，调整pH值并定容后，分装20 mL加于50 mL广口三角瓶中，棉塞封口后于121 °C高压蒸汽灭菌30 min，待冷却后备用。
(2)测试培养基。灵芝菌糠悬液培养基测试选取灵芝菌糠浓度、菌糠处理工艺、辅料玉米粉添加量3因子，设计全因子试验，因子和水平及培养基各处理配比见表1，所有处理以及CK对照组皆设3个重复。 取50 mL广口三角瓶，除对照组CK外，按表1中各处理对应的因子和水平加入灵芝菌糠、玉米粉和蒸馏水后，玻棒搅动至玉米粉和菌糠均匀分散，不经调节pH值，棉塞封口后于121 °C高压蒸汽灭菌30 min，待冷却后取出，超净台内晾干表面残水后备用。各处理皆设3个重复。
(3)对照及计数培养基。与种子培养基相同的YEPD培养基作为测试培养基的对照组CK，测试培养基，亦设3个重复，配方及制备方式同1.1。计数培养基为YEPD固体琼脂平板。如上述YEPD液体培养基中加入琼脂20 g・L-1，于121 °C高压蒸汽灭菌30 min后倾注90 mm平板备用。
1.4 培养方法
种子的制备：取制备好的YEPD液体培养基，以100 μL移液枪接入保藏酵母菌种10 μL，置于恒温摇床中，160 r・min-1，25 °C培养48 h后立即使用。
测试培养基的接种：以YEPD培养基中摇瓶培养48 h的'毕赤酵母菌液作为种子，于超净台上振荡混匀后以移液枪吸取菌液接入各处理中，每瓶接种10 μL。摇匀后，置于恒温摇床中，160 r・min-1，25 °C避光培养。
经由预备试验，通过血球计数板进行活菌计数[11]，确定培养基中的酵母最大生物量大致出现在培养52 h之后。因此，在酵母培养至第48 h后，每隔约4 h取样，取样时将三角瓶移入超净台中，用振荡器充分摇匀发酵液，移液枪吸取10 μL发酵液注入预先灭菌并干燥后的1 mL聚丙烯离心管中。各处理及其重复同一时间点取样各1次，并记录准确取样时间。取样后重新加棉塞，移入恒温摇床继续培养，重复上述过程直至各培养基发酵至72 h。
1.5 计数方法
采用梯度稀释―微量点样法[12]进行酵母活菌计数。具体操作如下：将含有取样样品的聚丙烯离心管中加入90 μL无菌蒸馏水，振荡器充分混匀后即为发酵液10-1梯度。从此离心管中再取10 μL再加入新离心管中，以移液枪加入90 μL无菌蒸馏水，以振荡器充分混匀后即为发酵液10-2梯度，以此类推至10-15为止。
使用移液枪将上述各梯度稀释液分别吸取10 μL，按稀释度的大小顺序点样于1.3所述YEPD琼脂平板上，不加涂布，任其自然形成稀释液的圆型斑点。各稀释度点样3次重复。点样后静置平皿待稀释液已被平皿琼脂表面吸收后，加盖并标记各点样处所对应的稀释倍数和测试培养基编号，放置于25 °C恒温箱避光静置培养48 h。
菌落形成后，对各稀释梯度斑点中的酵母菌落进行手工计数和统计。为避免系统误差，仅选取菌落数量大于3个小于40个的稀释梯度进行发酵液中酵母活细胞数的计算。若有1个以上的稀释液斑点满足上述规则，则对比二者之间的比值，若比值小于等于2即取平均数，若比值大于2则只记录稀释倍数较大、菌落总数较小的斑点;若所有稀释液斑点中的菌落数均大于40则以最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数计算;若菌落数均小于3则以最低稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数计算;若都不存在菌落则以1乘以最小稀释倍数计算。