论急性运动对骨骼肌mTOR信号通路的影响
摘 要:目的:研究急性运动或AICAR注射对mTOR及下游信号的影响,旨在探讨AMPK调控骨骼肌蛋白合成的机制。方法:52只雄性SD大鼠分为4组:安静对照组(n=8)、运动组(n=18)、生理盐水注射对照组(n=)、AICAR注射组(n=18)。运动速度26 m/min,坡度10%,时间60 min。运动和注射组分别在结束后即刻、1h、6 h和1 h、2 h、6 h取材。结果:运动后即刻、注射后1 h,mTOR Ser2448磷酸化(分别下降45%和38%)和4E-BP1 Thr37/46磷酸化均显著降低(分别下降34%和38%),运动后1 h和注射后2 h mTOR及4E-BP1开始增加,6 h达峰值。注射组S6K1 Thr389磷酸化水平在各时间点无显著变化,运动组均显著升高(分别增加42%、52%和57%)。结论:一体育论文网次性剧烈运动或AICAR注射导致蛋白合成的暂时抑制,其机制与AMPK下调mTORSer2 448及其下游信号4E-BP1 Thr37/46的磷酸化水平有关,但未发现S6K1 Thr389磷酸化水平的下调。
关键词:AMPK;mTOR;蛋白合成;骨骼肌
近年来,一些研究证实5′-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(5′- AMP activated protein kinase , AMPK)能抑制蛋白合成[1-2],其分子机制可能涉及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路[3]。AMPK通过何种机制调控mTOR信号通路目前还未阐明,初步的研究涉及mTOR信号通路上的多个分子如PKB、TSC2、mTOR、4E-BP1、S6K1等,但其作用的主要靶点还不清楚。急性运动或AICAR注射时,AMPK活性和mTOR信号通路的变化时程有什么特点?二者有什么样的关系?目前未见报道。本实验采用一次性运动、一次性AICAR注射方法,研究运动或AICAR对骨骼肌mTOR信号通路的影响,探讨AMPK抑制骨骼肌蛋白合成的分子机制。实验假设AMPK对蛋白合成的抑制涉及mTOR信号通路。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
实验动物:8周龄健康雄性SD大鼠,体重180~200 g,由北京大学医学部实验动物中心提供。昼夜节律人工控制光照(光照时间为07:00-19:00),环境温度(23±2)℃,动物自由取食及饮水。分组:52只雄性SD大鼠分为安静对照组(n=8)、运动组(n=18)、生理盐水注射对照组(n=8)、AICAR注射组(n=18)。表1 一次性AICAR注射或运动分组及体重g组别即刻取材1 h取材2 h取材6 h取材安静组240±10(n=8)运动组256±6(n=6) 252±11(n=6)—256±7(n=6)生理盐水注射组189±6(n=8)AICAR注射组—191±5 (n=6) 186±6(n=6) 188±7(n=6)投稿日期:2008-04-22基金项目:国家自然科学基金项目,批准号:30671013。通信作者:曾凡星。作者简介:张国华,副教授,博士,研究方向运动生理学。 注射和运动方案:注射组以0·5 mg/g体重剂量在大鼠后肢大腿外侧皮下一次性注射AICAR溶液(浓度为65 mg/mL),生理盐水注射部位、剂量同AICAR。运动组以26 m/min的速度,10%的坡度进行一次性运动,时间为60 min。
1·2 取材方法
运动组分别在运动后即刻、1 h、6 h取材,AICAR注射组分别在注射后1 h、2 h、6 h取材。取材前动物用20%的乌拉坦腹腔麻醉(0·8 mL/100 g体重)后,速取右后肢腓肠肌的白肌部分(位于腓肠肌外侧浅层)约200 mg,装入冻存管后投入液氮中保存,用于AMPK活性及mTOR、4E-BP1和S6K1磷酸化测定。
1·3 测试方法
AMPK活性的测定采用放射性同位素方法,即根据AMPK使特异性肽底物SAMS(氨基酸序列为HMR-SAMSGLHLVKRR)磷酸化的原理,以[γ-32P]ATP作为磷供体检测酶的活性。按照ShinTerada[4]和Wim[5]提供的方法进行,AMPK活力单位: 30℃条件下,每分钟将1 nmol磷催化转入SAMS的酶量即1个单位酶活。mTOR、4E-BP1、P70S6K1磷酸化测定采用western blot方法。
1·4 统计处理
全部统计学分析均采用SPSS13·0统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差(X±SD)表示,计量资料的比较用单因素方差分析。显著性水平取P<0·05,非常显著性水平取P<0·01。
2 结 果