门静脉转流下大鼠门静脉缺血对肝脏能量代谢的影响
毕业论文作者：冯春林 别平 林恒 谭轶峰 黄波 李昆
【摘要】 目的 探讨在门静脉转流下大鼠门静脉缺血后肝脏能量代谢变化。方法 在门静脉转流下阻断门静脉不同时间后，观察大鼠存活率、肝细胞线粒体呼吸活性、肝组织ATP含量及动脉血酮比值。结果 在门静脉缺血60、90及120 min后7 d大鼠存活率分别为100%、100%及40%；缺血后肝脏能量代谢功能明显受损，再灌注后24 h，门静脉缺血60、90 min两组大鼠肝脏能量代谢功能已有明显恢复，而门静脉缺血120 min组仍维持在低水平。结论 在门静脉转流下大鼠门静脉缺血90 min以内肝脏能量代谢损害可逆，而门静脉缺血120 min则不可逆。
【关键词】 门静脉缺血； 能量代谢； 大鼠
【Abstract】 Objective To study changes of hepatic energy metabolism after portal vein ischemia under portal vein bypass and discuss their relation with tolerance limit of rats. Methods Rat survival rate, hepatocytic mitochondrial respiratory function, hepatic ATP content and ketone body ratio in arterial blood were investigated at different time after portal vein ligation under portal vein bypass. Results The survival rate of rats at postoperative day 7 was 100%, 100% and 40% when they were subjected to 60, 90 and 120 minutes of portal vein ischemia. The hepatic energy metabolic function weakened markedly after ischemia but recovered evidently in groups subjected to 60 and 90 minutes of portal vein ischemia after 24 hours of reperfusion. While hepatic energy metabolic function remained at low rate in group with 120 minutes of portal vein ischemia. Conclusion Hepatic energy metabolic function is reversible in rats with portal vein ischemia within 90 minutes but irreversible in those with 120 minutes of portal vein ischemia.
【Key words】 Portal vein ischemia; Energy metabolism; Rats
在临床上，我们常常碰到侵犯门静脉的肿瘤。为提高根治率，术中阻断并部分切除受侵门静脉段，再行血管重建。因此，研究门静脉缺血对肝脏的影响具有重要临床意义和应用价值。研究表明门静脉血流阻断所致胃肠淤血及血流恢复后缺血再灌注损伤是影响肝脏耐受缺血时间的重要因素［1-2］。本研究以大鼠肝尾状叶引流门静脉血流来消除胃肠道淤血［3］，探讨门静脉血流阻断后肝脏能量代谢变化。
1 材料与方法
1.1 实验动物
Wistar大鼠168只，雌雄不限，220～250 g/只，由第3军医大学大坪医院动物中心提供。术前禁食12 h，自由饮水，术后自由进食和饮水。手术均采用乙醚吸入麻醉，经腹部正中切口。
1.2 动物实验模型的制作
本实验动物模型根据文献［4］进行制作。
1.3 实验动物分组
分4组，每组42只。(1)假手术组(S组)：行肝102指肠游离，分离出门静脉各分支，不阻断，预定时间关腹。(2)门静脉血流阻断60 min组(P?60组)。(3)门静脉血流阻断90 min组(P?90组)。(4)门静脉血流阻断120 min组(P?120组)。
1.4 观察指标及方法
各组动物分别于缺血后0 h，再灌注1、6、24 h采集腹主动脉血及肝组织进行肝脏能量代谢指标的检测，每时相点6只动物。
1.4.1 存活率：每组10只动物，统计术后10 d生存率。
1.4.2 肝细胞线粒体呼吸活性：线粒体提取及活性测定分别采用Johnson差速离心法和Clark氧电击法，呼吸状态区别为S3、S4，两者之比即为呼吸控制率(RCR)，计算磷氧比值(P/O)。
1.4.3 肝组织ATP含量：采用生物发光法检测。
1.4.4 动脉血酮体比值：动物在预定时相点剖腹后，从腹主动脉穿刺抽血1.5 ml，按文献［5］所介绍的方法测定血酮比值(AKBR)。
1.4.5 肝脏病理组织学观察：术后预定时相点活杀取肝组织，10%甲醛固定24 h，脱水、透明、石蜡包埋、切片及苏木精?伊红染色，光镜下观察。
1.5 统计学分析
采用SPSS 11.0统计软件包，数据以±s表示，行独立样本t检验，Levene′s test检验方差齐性。
2 结果
2.1 门静脉转流下大鼠门静脉缺血后的存活率
S组、P?60组、P?90组及P?120组大鼠术后7 d存活率分别为100%、100%、100%及40%。P?120组存活率明显降低(P<0.05)。
2.2 肝脏能量代谢状态
2.2.1 肝细胞线粒体呼吸活性：与S组相比，各组动物肝脏缺血后线粒体S4、RCR及P/O均降低；再灌注早期上述指标继续降低，P?60组和P?90组再灌注6 h后逐渐回升，至再灌注24 h已显著升高(与S组比，P<0.05)，但P?120组上述指标再灌注24 h内始终维持在低水平，显著低于P?90组，见表1。
2.2.2 肝组织ATP含量：缺血后各组大鼠肝组织ATP含量显著下降(与S组比，P<0.05)。再灌注后ATP水平逐渐回升，但随缺血时间延长，回升幅度降低；再灌注6 h时，P?60、P?90两组ATP含量已接近S组(P>0.05)，但P?120组仍维持在低水平；再灌注24 h，P?60、P?90及P?120组肝组织ATP水平分别恢复至缺血前的102%、93%、46%，见表2。
2.2.3 动脉血酮体比值：与S组比较，缺血后各组AKBR显著下降，P?120组较其他两组下降更明显。肝脏复流后AKBR逐渐回升，其中P?60、P?90两组AKBR再灌注1 h就恢复至缺血前水平(与S组比，P<0.05)；P?120组AKBR在再灌注后24 h才有显著回升，但仍低于S组(P<0.05)；再灌注24 h，P?60、P?90、P?120组AKBR分别恢复至缺血前的110%、109%和63%。在各再灌注时相点P?120组AKBR显著低于其他各组，见表3。
2.3 肝脏病理组织学观察
肝脏复流24 h肝脏组织病理学改变有以下特点：(1)P?60、P?90两组肝脏呈不同程度弥漫性肝细胞空泡变性、散在炎细胞浸润及肝细胞坏死(图1A，B)，肝脏损伤程度随肝脏缺血时间延长而加重。(2)P?120组肝脏呈大片状肝细胞坏死，残存肝细胞呈空泡变性或嗜酸性变，肝窦、中央静脉及汇管区血管扩张、充血(图1C)。 表1 各组不同时相肝细胞线粒体呼吸功能参数表2 肝组织ATP含量表3 各组不同时相动物血酮比值
3 讨论
门静脉是肝脏的功能血管，不仅供应70%～75%的'血量和40%～60%的氧量，还将胃肠道吸收的营养、某些有毒物质、促肝再生的营养因子和激素成分输入肝内进行加工代谢［6］。1旦门静脉缺乏血供，必然造成肝脏损害。本研究消除了胃肠道淤血造成的肠道屏障功能障碍及全身血流动力学紊乱，真实地反映门静脉缺血对肝脏的影响。本研究结果显示，门静脉血流阻断对肝脏能量代谢的影响有以下特点：(1)门静脉缺血后肝细胞线粒体活性、肝组织ATP含量及动脉血酮体比值均有不同程度的下降，且随缺血时间的延长，降低更明显。(2)再灌注早期肝细胞线粒体RCR及P/O进1步降低，然后有不同程度回升；再灌注24 h，P?60及P?90组上述指标显著升高，而P?120组仍维持在低水平，显著低于P?90组。(3)再灌注后各组动物肝组织ATP含量及AKBR比值逐渐回升，在再灌注后24 h，P?60及P?90组上述指标已有明显恢复，而P?120组上述指标1直维持在显著降低的水平，明显低于P?90组。(4)病理结果显示P?120组肝脏组织坏死的程度和范围较另外两个实验组严重。
门静脉阻断引起肝脏缺血?再灌注损害是1复杂的病理生理过程，可能与微循环紊乱、氧自由基、细胞因子、脂类介质的产生及失衡有关。而肝功能损害的严重程度及其缺血后能否顺利恢复与缺血时间密切相关。这与本实验中观察到的P?120组各项指标降低是1致的。肝脏长时间缺血及随后再灌注引起肝细胞线粒体功能和结构损伤，造成肝细胞线粒体呼吸链不可逆性破坏，氧化磷酸化系统脱耦联，从而表现为肝脏能量代谢功能严重受损，且在较长时间内无法得到恢复，引起肝脏损害不可逆的。
本研究结果显示门静脉缺血时间越长肝脏损害越重，门静脉缺血120 min再灌注24 h后肝脏能量代谢功能损害难以恢复，术后7 d存活率明显降低，而门静脉缺血90 min肝脏能量代谢功能损害，再灌注24 h后可以得到恢复，术后7 d全部存活。上述结果可能与门静脉缺血及随后的再灌注引起肝细胞线粒体结构及功能的严重损害有关。
综上所述，我们认为大鼠门静脉转流下，门静脉缺血超过90 min大鼠肝脏出现不可逆损害。但本研究仅基于动物实验，在临床上还须做进1步的研究。
【参考文献】
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