浅论川芎嗪对内皮祖细胞的功能影响

浅论川芎嗪对内皮祖细胞的功能影响

毕业论文

                   作者(冒号)：林杰 徐力辛 杨德业 黄伟剑 林捷 张怀勤

【摘要】  　　［目的］观察川芎嗪（TMP）对体外培养内皮祖细胞（EPCs）功能影响和损伤保护作用，探讨它对冠心病的治疗作用。［方法］密度梯度离心法获取脐血单个核细胞,培养7天后,收集贴壁细胞，流式细胞仪、荧光显微镜法、matrigel试剂鉴定EPCs。收集贴壁细胞并分组为正常对照组，TMP（5mg/L、25mg/L、100mg/L、200mg/L）干预组，H2O2（500μmol/L）氧化应激模型组，TMP（5mg/L、25mg/L、100mg/L、200mg/L）和H2O2共同干预组，培养24h。分别观察EPCs增殖、粘附能力及凋亡率。［结果］与正常对照组相比,（5mg/L、25mg/L、100mg/L）TMP干预组对脐血来源的EPCs增殖、粘附功能无显著影响，（200mg/L）TMP干预组显著抑制脐血来源的EPCs增殖、粘附；与H2O2氧化应激损伤组相比，（5mg/L、25mg/L、100mg/L）TMP能显著降低H2O2对EPCs增殖、粘附抑制作用及细胞凋亡。［结论］低浓度TMP能保护EPCs氧化应激损伤，改善增殖、粘附能力，减少细胞凋亡，但对正常培养的EPCs增殖和粘粘功能无显著的促进或抑制作用。

【关键词】  川芎嗪 内皮祖细胞 过氧化氢 缺血性疾病 冠心病

　　Abstract(冒号)：［Objective］ This study was to investigate the effect of TMP on function of EPCs in normal or hydrogen peroxide（H2O2）inducing injury model cell culture，and to approach a therapy to coronary heart disease（CHD）.［Method］ Total mononuclear cells were isolated from the cord blood by ficoll density gradient centrifugation，cultured in vitro.After the cells cultured for 7 days，identified them by cellmarkers and the ability of intaking the ac?LDL，and made sure they were EPCs.To divide the cells into three groups，TMP（5,25,100，200mg），H2O2（500μΜ）model and TMP together with H2O2，cultured for 24h and then detected the function and apoptosis of EPCs.［Result］ Versus to control group，the TMP （5，25，100mg）groups had no important effect on the proliferation and adhesion of EPCs，but TMP （200mg）group had negative effect on EPCs.Versus to H2O2 model group，TMP （5，25,100mg）preincubated groups had important protective effect on EPCs in proliferation，adhesion and apoptosis.［Conclusion］ TMP could protect EPCs from oxidative stress injury，but had little benefit to EPCs in normal incubation.

　　Key words(冒号)：tetramethylpyrazine；endothelial progenitor cell；hydrogen peroxide；ischemic disease；coronary heart disease

　　内皮祖细胞（EPCs）的概念提出已有10年，目前普遍认为EPCs的表面标记为CD34、CD133、KDR，能进1步分化为成熟血管内皮细胞参与血管新生的干/祖细胞。川芎嗪（TMP）是从活血化瘀中药川芎的根茎中提取的有效成分,对脐静脉内皮具有促增殖和内皮损伤保护作用［1］，并能抑制内皮细胞增殖及新生血管形成［2］，已应用到部分临床心、脑血管等疾病的治疗并取得较好的疗效［3］。而TMP对EPCs功能影响和损伤及保护作用，尚未见报道。本实验旨在观察TMP对体外培养正常和损伤EPCs的功能影响。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  6％羟乙基淀粉购自Sigma公司，纤维连接蛋白购自Roche公司，VEGF购自PeprotechEC公司，PE?CD34购自Caltag laboratories,FITC－VE?cadherin购自Bender system公司，PE?VEGF?2及FITC?AC133购自R＆D System,胎牛血清、购自GIBCO公司，Dil?ac?LDL购自Molecular probe公司，FITC?UEA、TMP购自Sigma公司，CCK?8细胞计数试剂盒购自日本株式会社同仁化学研究所，matrigel购自BD biosciences公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  人脐血培养EPCs脐血采集于温州医学院附属第1医院产科分娩室（已获得知情同意）。培养参考文献［4］，取健康孕妇分娩后脐血50ml,以密度梯度离心法分离脐血中单个核细胞,以5×107cells度接种于包被有纤维连接蛋白的25cm2培养瓶中,每皿加入5ml包含有20%胎牛血清、VEGF（10μg·L-1）,青霉素（105U/L）及链霉素（105U/L）的M199培养液,置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。3d后,洗去未贴壁细胞,添加培养液继续培养,以后每隔3d换培养液。

　　1.2.2  EPCs鉴定  在培养第3天时形成细胞集落；在培养的第7天细胞以0.25%胰酶消化后,制成109·L-1的单细胞悬液,加入荧光标记的抗CD34、VE?Cadherin、VEGFR?2及CD133单克隆抗体各10μl（1g·L-1）,流式细胞仪分析其表达情况；将DiI?ac?LDL以2.4mg·L-1的终浓度加入培养液共孵育3h,2％的多聚甲醛固定10min,再加入3ulFITC?UEA,（避光操作），37℃孵育1h，荧光显微镜下观察，以不加DiI?ac?LDL和FITC?UEA的同批培养细胞为对照，阴性对照采用SGC7901；将matrigel试剂、96孔培养板以及枪头于4℃冰箱过夜，在冰上操作，取50ulmatrigel试剂每孔，于37℃孵育半小时成胶待用，0.25%胰酶消化后制成细胞悬液接种于铺好成血管试剂的96孔板，培养48h在倒置显微镜下观察管腔形成

　　1.2.3  分组  培养第7天的各组细胞以0.25%胰酶消化后,制成细胞悬液计数，分为正常对照组、TMP（5mg/L、25mg/L、100mg/L、200mg/L）干预组、H2O2（500umol/L）氧化应激模型组［6］、TMP（5mg/L、25mg/L、100mg/L）预处理6h后和H2O2共同干预组，共培养24h后进行增殖、粘附功能及细胞凋亡的检测。

　　1.2.4  增殖能力测定  制成细胞悬液计数，将等数量EPCs接种到96孔培养板随机分为各组,每组6孔,培养48h后,弃培养液加入100μl新鲜含3％胎牛血清M199培养液，每孔10μLcck?8，37℃培养2.5h后,置酶标仪于波长450nm处测吸光度值（A）。

　　1.2.5  粘附能力测定  制成细胞悬液,以为1×104/cm2的接种密度接种到24孔板,分为各组每组3孔,培养48h后,各组细胞以0.25%胰酶消化制成细胞悬液，以相同细胞数接种96孔板每组6孔,置37℃培养箱中培养30min,洗去未贴壁细胞,倒置显微镜下随机选取10个视野（×400）计数粘附细胞数。

　　1.2.6  细胞凋亡检测  在培养的第7天之后，以0.25%胰酶消化下来制成细胞悬液,以5×105cells接种6孔板，0.25%胰酶（不含EDTA）将各孔细胞消化,PBS洗两次成细胞悬液,收集1×105cells离心，加入500μl Binding Buffer重悬浮细胞，加入2μl Annexin V?FITC混匀后，加入5μl Propidium Iodide（PI）染料，混匀、避光、室温反应10min，流式细胞仪上机检测细胞凋亡情况。Annexin v单阳性为早期凋亡细胞，以正常组早期凋亡率为100％,计算各组与正常组早期凋亡率之比。

　　1.2.7  统计分析  所有结果以x±s表示,输入SPSS13.0软件包，采用单因素方差分析比较各组均数,P<0.05为有显著性差异。

　　2  结果

　　2.1  EPCs鉴定  培养3d后形成集落（图4），培养第7天用流式细胞仪分析表明,表达CD34、CD133、VEGFR?2、VE?Cadherin的细胞分别为（78.51±5.53）%、（10.15±4.45）%、（15.24±3.61）%及（64.48±6.56）%。荧光显微镜检显示(冒号)：细胞吞噬DiI?ac?LDL，显微镜下激发红色荧光（图1）,细胞吞噬FITC?UEA，发绿色荧光（图2），两图重叠见图3。空白对照及阴性对照均无荧光。血管生成matrigel试剂盒检测EPCs的体外成血管能力。细胞拉长变形,长度为宽度的4倍以上即可被认为形成小管状，典型血管状为梭形细胞围成的多边形官腔样（图5）。体外培养14d后可形成条索状结构（图6）。

　　2.2  对EPCs增殖、粘附功能的影响  由表1可知，与对照相比，TMP在5～200mg/L浓度范围内，低浓度的TMP对EPCs增殖、粘附能力无显著促进或抑制，高浓度TMP则抑制EPCs增殖、粘附功能；与H2O2氧化应激模型相比，低浓度的TMP可显著降低H2O2对EPCs的增殖、粘附功能损伤。

　　2.3  对EPCs早期凋亡率的影响  由表1可知，TMP在浓度5～100mg/L范围内对H2O2致EPCs凋亡起保护作用。  

　　图1  细胞吞噬DiI?ac?LDL（×100）（略）  

　　图2  细胞吞噬FITC?LEA（×100）（略）

　　图3  DiI?ac?LDL与FITC?LEA重叠荧光图（略）

　　图4  培养3d后形成集落（×100）（略）

　　图5  多边形官腔样（×100）（略）

　　图6  14d后形成条索状结构（略）

　　表1  不同浓度的TMP对外周血EPCs的增殖、粘附功能及凋亡影响（略）

　　Note(冒号)：Versus to control group，*P<0.05，**P<0.01,Versus to H2O2 group,△P<0.05，△△P<0.01

　　3  讨论
   
　　从1997年ashara等［7］发现成体存在皮祖细胞，EPCs作为1种可以形成新生血管和分化为成熟血管内皮细胞的种子细胞的研究方兴未艾并取得了1系列巨大的研究成果。临床上缺血性疾病尤其是冠心病往往合并有1种或多种心血管疾病危险因素。心血管危险因素的数量与循环中的EPCs的数量呈负相关，因而有学者认为循环中EPCs的数量可以作为冠心病预后的指标。提示提高循环中EPCs的数量和改善其功能有助于防治心血管疾病。Dernbach等［6］研究发现与脐静脉内皮细胞相比EPCs具有较低的活性氧水平，以往实验已证明氧化应激损伤可缩短端粒，促使细胞衰老、凋亡［9］。而TMP对冠脉内皮损伤、缺血再灌注心肌损伤的保护作用与超氧歧化酶、1氧化氮合酶水平显著升高相关作用［10］。
   
　　本实验发现低浓度的TMP对正常培养EPCs增殖、粘附功能无显著促进或抑制，高浓度则起抑制作用。H2O2是活性氧，促进大量氧化自由基和脂质过氧化，损伤细胞活性，促使细胞衰老及凋亡。低浓度TMP和H2O21起干预培养很显著降低H2O2对EPCs活性抑制。推测TMP对EPCs损伤保护作用可能同清除氧化自由基，抑制胞内钙超载，增强抗氧化酶的活性，抑制端粒加速缩短有关，具体的调节途径有待能进1步实验明确。本实验为TMP对治疗合并有高血压、糖尿病、动脉粥样硬化的冠心病可行性提供了1定的理论支持。

【参考文献】
  　　［1］ 任自力，吕中，楼正青.补气活血方药对冠心病血瘀证单核细胞凝血、纤溶活性作用研究［J］.浙江中医学院学报，2002，26（3）(冒号)：18?19.

　　［2］ 林蓉.川芎嗪对血管内皮细胞损伤的保护作用［J］.中国药理学与毒理学杂志，2000，14（6）(冒号)：425?429.

　　［3］ Zou Y，Jiang W，Chiou GC.Effect of tetramethylpyrazine on rat experimental choroidal neovascularization in vivo and endothelial cell cultures in vitro［J］.Curr Eye Res，2007,32（1）(冒号)：71?75.

　　［4］ 张怀勤.脐血来源的人类内皮前体细胞培养的实验研究［J］.中国循环杂志，2003，18（6）(冒号)：456?457.

　　［5］ Dernbach E，Urbich C，Brandes RP，et al.Antioxidative stress–associated genes in circulating progenitor cells(冒号)：evidence for enhanced resistance against oxidative stress［J］.Blood，2004,104（12）(冒号)：3591?3597.

　　［6］ Asahara T,murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenensis［J］.Science，1997，275（5302）(冒号)：964?967.

　　［7］ Smith LL，Coller HA，Roberts JM.Telomerasemodulates expression of growth?controlling genes and enhances cell proliferation［J］.Nat Cell Biol，2003，5(冒号)：474?479.

　　［8］ Von zglinicki T.Oxidative stress shortens telomeres［J］.Trends biochem sci,2002，27(冒号)：339?344.

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