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三七总苷对佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞释放一氧化氮的影响探析
【摘要】
［目的］研究37总苷（PNS）对佐剂性关节炎（AA）大鼠腹腔巨噬细胞释放1氧化氮（NO）的影响。［方法］大鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂诱发大鼠AA模型，采用硝酸还原酶法检测AA大鼠腹腔巨噬细胞释放的NO。［结果］体外给药PNS 0.4mg/ml，作用4h时，增加AA大鼠NO释放（P<0.05）；体外给药PNS 0.2mg/ml 及0.4mg/ml，作用8h时，抑制AA大鼠NO释放 （P<0.05，P<0.01）；体外给药PNS 0.8mg/ml及PNS 1.6mg/ml，作用24h时，增加AA大鼠NO释放 （P<0.01，P<0.05）。［结论］PNS体外给药随浓度及作用的时间变化，对AA大鼠释放NO有双向调节作用，PNS抑制 AA大鼠腹腔巨噬细胞释放NO可能在AA治疗中起1定的作用。
【关键词】 37总苷 佐剂性关节炎 1氧化氮
Abstract(冒号)：［Objective］To investigate the influence of panax notoginseng saponins （PNS）on production of Nitric Oxide（NO） by peritoneal macrophages of rats with adjuvant arthritis（AA）.［Methods］Complete Freunds adjuvant was used to induce AA in rats.Production of NO by peritoneal macrophages of rats with adjuvant arthritis was determined by nitrate reductase.［Results］PNS 0.4mg/ml increased NO synthesis and secretion from peritoneal macrophages of AA rats in vitro after four hours（P<0.05）；PNS 0.2mg/ml and 0.4mg/ml reduced NO synthesis and secretion from AA rats in vitro after eight hours respectively（P<0.05，P<0.01）；PNS 0.8mg/ml and 1.6mg/ml increased NO synthesis and secretion from AA rats in vitro after twenty?four hours respectively（P<0.01，P<0.05）.［Conclusion］ PNS has bidirection influence on production of NO by peritoneal macrophages of AA rats with change of concentration and times.PNS reduced NO synthesis and secretion from peritoneal macrophages of AA rats，which may be effective on treating AA.
Key words(冒号)：panax notoginseng saponins；adjuvant arthritis；Nitric Oxide
37Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen为5加科人参属植物的根，具滋补强壮、止血、活血化瘀、消肿止痛的功效。37总苷（panax notoginseng saponins，PNS）是37的主要活性成分，研究显示，PNS有较强的抗炎镇痛作用［1?2］。在临床实践中，我们应用PNS治疗类风湿关节炎，在短期内控制RA病情急性活动，减轻软组织肿胀，改善关节功能等疗效。为进1步探讨PNS抗炎作用的可能机制，本文进行了PNS对佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠腹腔巨噬细胞释放NO影响的研究。
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 模型制作及给药方法 动物实验性喂养2周后，参照文献［3］以卡介苗与弗氏不完全佐剂充分乳化混匀配成10mg／ml的乳剂，于每鼠右后足跖皮内注射0.05ml致炎。2周后分离腹腔巨噬细胞。
1.2.2 DMEM培养液配制
1.2.3 腹腔巨噬细胞的分离纯化及培养 大鼠颈动脉放血，腹腔注入预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）（PH7.2）10ml灌洗腹腔，轻揉腹部后取腹腔液。1200r/min离心10min，吸弃上清，用DMEM培养液混悬沉淀，调至5×108/L，加入24孔培养板中，每孔1ml，置入37℃、5%CO2培养箱内差速贴壁1h。吸弃培养液，用DMEM培养液洗3次，以除去非粘附细胞，获单层腹腔巨噬细胞。每孔加入含10%小牛血清DMEM培养液及LPS（终浓度为10μg/ml），并按如下6个实验组给予不同的处理，每组4孔，地塞sai米松（DM）作为阳性对照组。6个实验组依次是(冒号)：AA组、AA+PNS 0.2mg/ml组、AA+PNS 0.4mg/ml组、AA+PNS 0.8mg/ml组、AA+PNS 1.6mg/ml组、AA+DM 10?7mmol/L组。置37℃、5%CO2培养箱中分别培养1、4、8、24h，每次取0.2 ml上清液，-20℃保存待测。
1.2.4 1氧化氮检测 NO化学性质活泼，在离体标本液中主要氧化成亚硝酸盐，因此，测定标本中亚硝酸盐的浓度可作为衡量NO水平的指标。本试验取冻存培养液上清100μl，室温溶解后，依1氧化氮试剂盒说明书操作，以硝酸还原酶法测定标本液中的亚硝酸盐浓度，550nm，0.5cm光径，测吸光度值。NO含量（μmol/L）＝（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）×标准品浓度（100μmol/L）。
1.2.5 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件进行数据处理，测定值以均值±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验。以P<0.05为差异有显著性统计学意义。
2 结果
各组腹腔巨噬细胞释放NO量随时间变化的情况见表1。腹腔巨噬细胞培养1h时，各组间释放NO量的差异无统计学意义（P>0.05）；培养4h时，AA+PNS 0.4mg/ml组及AA+DM 10?7mmol/L组与AA组相比NO释放量升高，差异有显著性意义（P<0.05）；培养8h时，AA +PNS 0.2mg/ml组与AA组相比NO释放量降低，差异有显著性意义（P<0.05）；同时AA+PNS 0.4mg/ml组与AA组相比NO释放量也降低，差异有非常显著性意义（P<0.01）；培养24 h，AA+PNS 0.8mg/ml组及AA+DM 10?7mmol/L与AA组相比NO释放量升高，差异有非常显著性意义（P<0.01）；AA+PNS 1.6mg/ml与AA组的差异有显著性意义（P<0.05）。
表1 （略）
与AA组比较，*P<0.05，** P<0.01
3 讨论
NO对免疫系统有双重作用，既是免疫系统发挥作用所不可缺少的参与分子，又可由于过量产生而导致组织损伤。NO可促进巨噬细胞释放许多炎症介质，如肿瘤坏死因子（TNF?α） 和白介素1 （IL?1）等，在免疫性炎症病理中起重要作用［4］。大鼠佐剂性关节炎（AA）是用于RA发病机制研究及抗炎药物筛选的1种常规模型，研究表明由诱生型1氧化氮合酶iNOS诱导产生大量的NO，在大鼠AA发病机制中起重要作用［5］，AA大鼠的多发性关节病变与NO的过量产生有关［6］，对NO产生的抑制必然可使组织损伤得到1定程度的缓解，起到治疗作用［7］。
以往有学者研究PNS对降低烧伤小鼠腹腔巨噬细胞产生NO有显著的作用［8］。本研究结果显示，PNS 对AA大鼠腹腔巨噬细胞释放NO的调节作用与药物作用的时间及剂量有1定关系，在较小的浓度较短的时间（PNS0.4mg/ml，培养4h）以及较大的浓度较长的时间（PNS0.8mg/ml及PNS1.6mg/ml，培养24h）对NO的释放均有促进作用，而在1定的浓度和时间（PNS0.2mg/ml及PNS0.4mg/ml，培养8h）对NO的释放有1定的抑制作用。
由此可见，PNS体外给药对AA大鼠释放NO有双向调节作用，推测PNS对AA大鼠腹腔巨噬细胞释放NO的抑制作用可能在佐剂性关节治疗中起1定的作用。其双向调节作用的机制有待于进1步的研究证实。
【参考文献】
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