Runx3基因甲基化与胃癌发生和转移的关系
毕业论文作者：李华 李勇 范立侨 赵雪峰 宋振川 赵群 王力利 焦志凯 刘羽
【摘要】 目的探讨Runx3基因启动子甲基化与胃癌发生发展过程的关系。方法采用逆转录?聚合酶链反应(RT?PCR)检测80例胃癌组织及肿瘤周围粘膜组织中Runx3 mRNA的表达,同时用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测Runx3基因启动子甲基化情况。结果80例胃癌组织标本中Runx3基因的表达（0.5971±0.1013）较肿瘤周围组织中表达明显下调（0.8297±0.2912）,差异有统计学意义(P<0.05)。正常粘膜组织中未发现有Runx3基因启动子的甲基化,80例胃癌组织中有43例检测到Runx3基因启动子的甲基化,胃癌组织Runx3基因启动子甲基化率显著增高(P<0.05)。胃癌标本中Runx3 mRNA的表达与其病理临床特征密切相关，在低分化和有淋巴结转移胃癌组织标本中Runx3 mRNA的表达显著下调(P<0.05)。结论Runx3基因启动子甲基化是导致Runx3基因失活的主要原因之1并且与胃癌的发生、发展密切相关。
【关键词】 胃癌；Runx3基因；RT?PCR；DNA甲基化
1资料与方法
1.1资料
1.1.1标本80例胃癌组织标本取自我院2005年1月~8月的手术切除标本，立即放液氮中速冻，-80℃冻存备用。同时选取癌旁5cm组织作为对照。年龄28~80岁，中位年龄57岁,男45例,女35例,有淋巴结转移45例。所有标本术后均经病理证实。
1.1.2试剂Trizol 购自Invitrogen公司。cDNA第1链反应试剂盒购自Fermentas公司。PCR引物序列由上海生工生物工程公司合成。DNA纯化试剂盒购自Promega公司,氢酯和亚硫酸氢钠购自SIGMA公司。
1.2方法
1.2.1组织总RNA提取将组织标本研磨后，采用Trizol试剂按照说明书提取组织样本总RNA，备用。
1.2.2逆转录?多聚合酶链反应（RT?PCR）紫外分光光度计定量总RNA,调整浓度为1μｇ/μｌ。按cDNA第1链反应试剂盒说明书采用随机引物法合成cDNA。用GAPDH做为内参照进行PCR。Runx3的引物序列：上游：5'?GATGGCAGGCAATGACGA?3'，下游：5'?TGCTGAAGTGGCTTGTGGT?3', 扩增长度：353bp。GAPDH的引物序列：上游：5'?AACGGATTTGGTCGTATTG?3', 下游：5'?GGAAGATGGTGATGGGATT?3'，扩增长度：208bp。PCR 参数: 94℃ 5min变性; 94℃ 45s, 55℃ 55s, 71℃ 45s, 32个循环; 72℃延伸7min。PCR产物于2%琼脂糖电泳，电压60V，55min。Gel ID凝胶图像分析系统摄片分析测定其光密度。计算各个样本Runx3积分光密度（条带强度× 条带面积)与GAPDH内对照积分光密度的比值, 反映Runx3 mRNA表达的变化。
1.2.3DNA提取、纯化和亚硫酸盐修饰称取150mg标本在未解冻时迅速用眼科剪剪碎,然后按DNA纯化试剂盒说明书提取DNA。取1μg DNA加入50μｌ总体积中, 加2mol/L NaOH使其终浓度为0.2mol/L, 37℃变性处理10min。再加入新鲜配制10mmol/L氢酯20μｌ,520μｌ的亚硫酸氢钠,置于50℃水浴16h,修饰后的DNA用Wizard DNA clean up system纯化,加入NaOH (终浓度0.3mol/L)室温变性5min,加入3mol/L的醋酸钠中和后,乙醇沉淀回收DNA,此DNA溶于50μｌ TE缓冲液中, -20℃贮存备用。
1.2.4甲基化特异性PCR(Methylation 2specific PCR, MSP)甲基化特异性引物上游引物序列为5'? TTACGAGGGGCGGTCGTACGCGGG ?3', 下游引物为5'? AAAACGACCGACGCGAACGCCTCC ?3', 扩增片段为210bp。非甲基化特异性引物上游序列为5'? TTATGAGGGGTGGTTGTATGTGGG ?3', 下游引物为5'? AAAACAACCAACACAAACAACTCC ?3', 扩增片段为210bp,反应体系总体积为25μｌ, 甲基化反应条件为94℃ 5min 预变性，94℃ 30s, 65.6℃ 45s,72℃ 55s,共35个循环, 72℃延伸5min。非甲基化反应条件为94℃ 5min 预变性，94℃ 30s,61.2℃ 45s, 72℃ 55s,共35个循环, 72℃延伸5min。PCR产物5μｌ于1.5%的琼脂糖凝胶电泳,紫外线下观察拍照分析。
1.3统计学处理数据用±s 表示,采用SPSS10.0统计软件行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2. 1Runx3 mRNA在胃癌和癌旁组织中的表达Runx3和GAPDH引物的扩增基因片段经电泳和EB染色后，电泳结果显示扩增片段大小分别为353bp和208bp。Runx3表达量相对值在胃癌及癌旁组织中的表达，见表1。表1Runx3基因mRNA在胃癌及癌旁组织中的表达组织来源表达相对值（±s）tP胃癌组织0.5971±0.10136.7480＜0.01癌旁组织0.8297±0.2912表2Runx3基因甲基化在胃癌及癌旁组织中的表达组织来源甲基化表达(n)非甲基化
表达(n)χ2P胃癌组织433758.4360.001癌旁组织0802.2Runx3基因启动子甲基化在胃癌和癌旁组织中的发生率Runx3基因甲基化检测电泳染色后显示，癌旁组织内未发现Runx3基因启动子甲基化而胃癌组织标本中有53.75%(43/80)被检测到，见表2。
2.3Runx3的表达与胃癌临床病理相关因素的关系表3结果显示, Runx3 mRNA的表达与胃癌的分化程度及淋巴结转移有关(P＜0.05), 而与肿瘤部位及大小无关(P>0.05)。 表3胃癌组织Runx3基因mRNA
表达与临床病理特征的关系临床病理因素例数Runx3 mRNAχ2值和P分化程度低分化314χ2=3.950高分化4916P=0.047淋巴结转移有385χ2=5.414无4215P=0.020肿瘤大小<5cm5012χ2=0.071>5cm308P=0.790肿瘤部位胃窦4410χ2=0.269胃体3610P=0.604
3讨论Runt家族包括3个基因，其家族成员均具有含123个氨基酸的Runt Domain (RD区域)，Runx蛋白与Smad2、Smad3形成复合物传递TGF?β/activin信号，与人类疾病的发生密切相关。Runx3含有2个高度保守的`CpG岛，其中1个富含GC启动子的特征CpG岛较大，位于Runx3基因启动子P2周围，控制Runx3基因转录[1]。目前研究发现消化道肿瘤，如胃癌、胆管癌、胰腺癌和肝细胞癌中均有染色体1p36异常[6?7]。Runx3基因作为1种肿瘤抑制基因,与多种肿瘤的发生、发展相关。在45%~60%的胃癌细胞系和胃癌组织中，有紧邻P2启动区的CpG岛的甲基化[8，9]。Li等研究发现在30%胃癌中有1p36.1的杂合性缺失，而Runx3的点突变则为1/119[10]。本研究结果表明胃癌中Runx3的表达量明显低于正常粘膜组织，Runx3在伴有淋巴结转移组中明显低于未转移组。说明在胃癌发生、发展过程中Runx3基因表达有缺失并且与胃癌分期有关，因此，近年来部分学者更倾向于Runx3基因是1种抑癌基因，在胃癌发生中起重要作用。Runx3基因表达缺失主要是由于Runx3基因启动子甲基化所造成。本研究在正常粘膜组织中未发现有Runx3基因启动子的甲基化，而在胃癌组织中有53.75%检测到甲基化存在，这与文献报道相似[11]。因此Runx3基因启动子区域的高甲基化（CpG岛甲基化）可能是导致基因转录失活及其表达下调的主要原因。Runx3基因启动子区域高甲基化导致其在胃癌组织中表达明显下调且与胃癌发生、发展密切相关。因此，利用药物对Runx3基因进行去甲基化处理的进1步研究必将对胃癌的临床诊断和治疗带来新的启示。
【参考文献】
［1］Bangsow C, Rubins N, Glusman G, et al. The Runx3 gene?sequence, structure and regulated expression[J]. Gene, 2001，279(2):221?232.
[2]Zaidi SK, Sullivan AJ, van Wijnen AJ, et al. Integration of Runx and Smad regulatory signals at transcriptionally active subnuclear sites[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(12):8048?8053.
[3]Tokumaru Y, Nomoto S, Jeronimo C, et al. Biallelic inactivation of the RIZI gene in human gastric cancer[J]. Oncogene, 2003, 22(44):6954? 6958.
[4]Kang YK, Kim YI, Kim WH. Allelotype analysis of intrahepatic cholan?giocarcinoma[J]. Mod Patho1,2000,13(6):627?631.
[5]Fang W, Piao Z, Simon D, et al. Mapping of a minimal deleted region in human hepatocellular carcinoma to 1p36.13?p36.23 and mutational analysis of the RIZ(PRDM2) gene localized to the region[J]. Genes Chromosomes Cancer, 2000, 28(3):269?275.
[6]Ito Y. Molecular basis of tissue?specific gene expression mediated by the runt domain transcription factor PERP2/CBF[J]. Genes Cells, 1999，4(12):685?696.
[7]Warren AJ, Bravo J, Williams RL, et al. Structural basis for the heterodimeric interaction between the acute leukaemia?associated transcription factors AML1 and CBF beta[J]. EMBO J, 2000, 19(12): 3004?3015.
[8]Li QL, Ito K, Sakakura C, et al. Causal relationship between the loss of RUNX3 expression and gastric cancer[J]. Cell, 2002，109(1): 113?124.
[9]Waki T, Tamura G, Sato M, et al. Promoter methylation status of DAP?kinase and RUNX3 genes in neoplastic and non?neoplastic gastric epithelia[J]. Cancer Sci, 2003, 94 (4): 360?364.
[10]Miyazono K, Suzuki H, Imamura T, et al. Regulation of TGF?beta signaling and its roles in progression of tumors[J]. Cancer Sci, 2003, 94(3): 230?234.
[11]Oshimo Y, Oue N, Mitani Y, et al. Frequent loss of RUNX3 expression by promoter hypermethylation in gastric carcinoma[J]. Pathobiology, 2004， 71（3）: 137?143.
【Runx3基因甲基化与胃癌发生和转移的关系】相关文章：
1.党籍关系转移须知