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抗肿瘤药氯法拉滨的致突变性及溶血性研究
【摘要】 目的 了解氯法拉滨(简称CLO)对骨髓红细胞和雄性小鼠生殖细胞有无致突变和致畸作用，以及对外周血红细胞有无溶解作用。方法 采用微核试验检测CLO对骨髓RBC的致突变性，采用精子畸变试验检测CLO对小鼠生殖细胞的致畸作用，采用人红细胞检测CLO的溶血性。结果 经微核试验，CLO测试组与阳性对照组两组间差异无显著性(P>0.01)，与阴性对照组间差异有显著性(P<0.05)。精子畸变试验中，CLO测试组与阳性对照组之间差异无显著性(P>0.05)，而与阴性对照组之间差异有显著性(P<0.01)。CLO在体外各时段不致人红细胞溶解。结论 经检测，CLO同其他抗癌核苷酸类似药一样，可以引起体内增殖活性强的细胞的突变，以及生殖细胞的畸变;对人红细胞的溶解性为阴性。
【关键词】 氯法拉滨;微核试验;精子畸变试验;溶血性;致畸;致突变
多数抗白血病药物的药理作用是以抑制肿瘤细胞DNA合成以及抑制某些聚合酶的作用从而阻止肿瘤细胞增殖为特征。所以，世界卫生组织(WHO)曾宣布：从DNA入手才是治疗肿瘤的关键。氯法拉滨(简称CLO)即是如此，作为一种核苷酸还原酶抑制剂，可以使肿瘤细胞DNA合成终止达到杀伤肿瘤细胞的作用[1]，那么对正常机体的生殖细胞、骨髓红细胞及外周血红细胞的影响是怎样的呢?我们即对此进行了研究。本研究是以小白鼠和体外人红细胞为实验对象来了解CLO对它们的反应性。应用统计学方法，为评价CLO对生殖细胞畸变，对骨髓红细胞致突变作用的影响规律，以及对人红细胞的作用机制提供科学依据。
1 实验材料
1.1 药品与试剂 CLO制剂：某兄弟院校赠予。阳性对照物：环磷酰胺，山西普德药业有限公司，批号20070302。阴性对照物：生理盐水。Giemsa染液。pH6.8磷酸盐缓冲液。
1.2 实验仪器 医用离心机：TL80-1型，中国姜堰市天力医疗器械有限公司。 恒温水浴箱：TL-420D型，天力医疗器械有限公司。显微镜：日本OLYMPAS株式会社出品，型号CX200。
1.3 动物 8～12周龄昆明种小白鼠100只，雄性75只，雌性25只，由山东大学医学院新药评价中心提供，实验动物生产许可证号为：SCXK鲁20030004。
2 实验方法
2.1 微核试验[2～4]
2.1.1 CLO试验组 选用昆明种成年小鼠30只，雌雄各半，运达本室后称重标记，体重23～27g。饲养1周，以观察其健康状况使其适应本室环境，适当控制饮食，1周内使体重变化在4g左右。将CLO配成1mg/ml的浓度。给药：小鼠按200mg/kg灌胃给药，连续1周。骨髓涂片：第八天颈椎脱臼致死小鼠，解剖剪取胸骨;载玻片上滴加小牛血清，用止血钳挤压胸骨骨髓液点加于血清中。混匀，推片，自然干燥后滴加甲醇覆盖涂膜固定。染色：Giemsa染色，将固定好的涂片滴加Giemsa应用液，根据室温染色维持10～15min后，加2倍pH6.8磷酸盐缓冲液，继续染3～5min，用PBS冲洗，晾干。观察计数：用双盲法阅片，高倍镜下观察计数嗜多染红细胞的微核发生率，每只动物计数1000个细胞。
2.1.2 阳性对照 小鼠10只，雌雄各半，饲养方法、条件同上。取针剂环磷酰胺200mg，加生理盐水8ml，再作1：10稀释，使之成为2.5mg/ml的浓度。每只小鼠按40mg/(kg·d)做腹腔注射，连续2天，间隔24h，末次注射后6h处死，取骨髓细胞方法、染色方法、观察计数同CLO试验组，计数阳性对照组的微核率。
2.1.3 阴性对照 取小鼠10只，雌雄各半，称重后以0.4ml/(25g·d)的剂量以生理盐水灌胃连续7天，计数微核率方法同上。
2.2 精子畸变试验 此项试验选用健康雄性小鼠，体重23～27g。
2.2.1 CLO试验组 选用健康雄性昆明种小鼠30只，以CLO 20mg/kg灌胃给药7天后，处死小鼠、摘除附睾，用生理盐水将血液漂洗干净，置小烧杯中，用剪刀将附睾纵向剪开，加生理盐水1～1.5ml，用滴管反复适度吹打，使精子均匀散在液体中，静置1min。取上层悬液1滴，加在干净的载玻片上，盖上盖片，立即用高倍镜观察，检查精子的头部、体部和尾部的形态变化。以形态良好，游动活泼的精子为正常。以无头、小头、胖头、双头、双尾、无尾及无定形为精子畸形[3，5]，计数1000个精子的畸变率。
2.2.2 阳性对照试验 取雄性小鼠10只，腹腔注射环磷酰胺40mg/kg[5]，相当于体积剂量为0.4ml/(25g·d)，连续5天，取精子方法、计数精子畸变率法同试验组。
2.2.3 阴性对照 取雄性小鼠10只，以0.4ml/(25g·d)的剂量做腹腔注射生理盐水，连续7天，用药时间、取精子方法、计数畸变率同试验组。
2.3 溶血性试验 CLO测试物溶液以1mg/ml为原液进行稀释。
2.3.1 试管设定 分设阳性对照、阴性对照试管各1支，测试管1～5号，共7支。
2.3.2 红细胞悬液的制备 无菌抽取健康志愿者O型血5ml，置50ml无菌锥形瓶中用玻璃珠摇晃去除纤维蛋白，然后分取1/2移入2支10ml刻度离心管中，各加入生理盐水5ml，混匀，离心1500rpm 10min，弃上清，洗2次。将所得红细胞用生理盐水稀释成2%，备用[6]。
2.3.3 加样 取试管7支，编号。按表1所示，分别加入各溶液。表1 溶血性试验加样表 (ml)
第6管不加CLO溶液，只加红细胞溶液及生理盐水作为阴性对照;第7管不加CLO溶液和生理盐水，只加红细胞溶液和蒸馏水作阳性对照。1～5管为测试管，加入不同体积的CLO溶液和不同体积的生理盐水，使其成为递减的终浓度。将各管置于试管架上轻轻摇匀，置37℃中进行恒温水浴4h，分不同时段观察各管的溶血和凝集现象，必要时用显微镜观察红细胞是否完整。显微镜观察方法：将试管轻轻摇匀，取溶液20μl，滴于载玻片上，盖上盖片，高倍镜观察细胞的有无及完整性。
3 实验结果
3.1 微核试验 小鼠骨髓片经Giemsa染色后进行阅片，选择细胞完整、分布均匀，着色适度的区域，用高倍镜观察[1]。镜下：嗜多染红细胞呈灰白色，因成熟红细胞核糖体消失，被染成淡桔红色，微核大多情况下呈单个圆形，边缘光滑整齐，游离于细胞质中，嗜色性与核质相一致，呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的1/20～1/5，故称为微核。CLO测试物与阳性对照、阴性对照的微核发生率及其对照如表2所示。表2 CLO微核率与阳性对照、阴性对照实验结果
注：*CLO测试组与阳性对照,阴性对照的比较结果 CLO测试物与阳性对照和阴性对照的关系分析：采用SPSS11.0统计软件进行分析，所得数据用均数±标准差(〖x〗±SD)表示。经分析表明，CLO测试组与阳性对照组两者之间差异无显著性(P>0.01)，CLO测试组与阴性对照比较差异有显著性(P<0.05)。因此推断，抗癌新药CLO对骨髓红细胞有一定的致突变作用。
3.2 精子畸变试验 高倍镜观察：每只小鼠计数1000个精子，分计出正常与异常精子。统计学处理：使用SPSS13.0软件对统计数据进行χ2检验，组间比较用χ2分割法。结果见表3。表3 CLO精子畸变与阳性对照、阴性对照实验结果及比较
结果表明：精子畸变试验中，CLO测试组与阳性对照组差异无显著性(P>0.05)，而与阴性对照组差异有显著性(P<0.01)。因此，CLO对雄性昆明种小鼠有诱导遗传突变、精子致畸作用。
3.3 溶血性试验 在37℃水浴中，每隔15min观察1次，4次后每隔1h观察1次，共7次，有疑问者取20μl做压片，显微镜观察。实验结果判定参见表4。根据以上标准，CLO溶血性试验结果见表5。表4 红细胞溶血、凝血判断标准表5 CLO溶血性试验结果
蒸馏水阳性对照管在15min观察，溶液红色透明，管底无红细胞沉淀，镜下无细胞，即为全部溶血。生理盐水阴性对照管和1～5号CLO测试管各时段均为上部无色透明，红细胞全部沉入管底，摇后红细胞分散，液体呈红色混浊。显微镜下观察形态，数量正常，表示不溶血。
4 讨论
4.1 CLO对小鼠骨髓嗜多染红细胞形成微核的效应 我们采用的小鼠微核试验是20世纪70年代初建立的一种利用哺乳动物骨髓细胞染色体改变来测定突变作用的实验方法。具有检测对骨髓细胞作用及染色体损伤效应的方便、快捷、可靠的特点。已被国际组织如国际经济合作和发展组织(OECD)、国际诱变剂、致癌剂防护委员会(ICPEMC)等推荐为检测致癌剂、诱变剂广泛应用的遗传毒理学方法之一[7～9]。因此，我们利用微核试验作为实验手段是可行的。微核的形成，起因于染色体断片或有丝分裂器紊乱，是由染色体断片或整条染色体在细胞分裂后期，不能移到细胞纺锤体两极而游离于细胞浆中而形成的。致断裂物质和纺锤体抑制剂都能导致微核的形成。CLO作为一种核苷酸类似物[8～10]，其经脱氧胞苷激酶磷酸化为三磷酸盐。首先能有效地抑制核苷酸还原酶，使DNA合成终止;同时也能抑制DNA聚合酶a ，使DNA链不再延长，形成染色体断片。CLO对不同的细胞株和肿瘤模型都表现出很强的抗癌活性，因此，具有较强的细胞毒性。有报道称[1]，在2mg/m2的浓度剂量下，干细胞中CLO的代谢产物三磷酸盐水平持续保持较高水平，此水平可持续抑制DNA的合成。目前，抗肿瘤药物的特点是治疗指数较小，选择性较差。在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常组织细胞特别是增殖更新较快的正常组织如骨髓、胃肠黏膜上皮、淋巴组织、毛囊和生殖细胞等产生不同程度的损害[10]。因此，在骨髓红细胞的增殖过程中，可引起染色体有丝分裂紊乱而形成微核是必然的。我们的实验结果，CLO与阳性对照组差异无显著性(P>0.01)，而与阴性对照组差异有显著性(P<0.05)，与有关报道[1]相一致。
4.2 CLO对雄性小鼠生殖细胞的影响 精子畸变试验是判断化合物是否具有生殖毒性的常用方法[3，5]，也是检测致癌剂、诱变剂常用的遗传毒理学方法，它是以精子的畸变率来评价化合物的生殖毒性和诱变性的。此试验简单、经济，可重复性强，实验终点明确，结果阳性的化合物可认为是哺乳动物生殖细胞的潜在诱变剂。在本研究中，精子畸变试验的阳性对照环磷酰胺和阴性对照的生理盐水两组间比较，差异有显著性(P<0.01)，证明本试验系统具有可靠性[3，11，12]。研究结果表明，CLO测试组精子畸变率与阳性对照组差异无显著性(P>0.05)，而与阴性对照组差异有显著性(P<0.01)。因此，CLO对雄性昆明种小鼠有精子致畸作用，即可诱导遗传突变。测试物诱变的作用机制在于诱发小鼠初级精母细胞染色体畸变，初级精母细胞染色体的变化，主要原因分析为细胞增殖周期中期的终变细胞DNA损伤而导致的[10]。
4.3 CLO对体外红细胞的溶解性 对于一种新药的处方工艺研究，溶血性亦是一个重要的筛选指标。目前，国家食品药品监督管理局审评中心所发布的溶血试验指导原则，是使用常规肉眼观察法检测制剂的溶血性。用该法检测CLO的溶血性时，各时段均未有溶血现象，表明CLO的渗透压及pH值与人红细胞相一致，对红细胞膜有很好的保护作用。据报道[1]，CLO对不同的细胞株和肿瘤模型都表现出很强的抗癌活性。研究表明，本品的浓度水平在微摩尔以下就能有效地抑制人体CNS肿瘤，如肺癌、肾癌、白血病细胞和黑色素瘤细胞等的增殖。在一定剂量下[4mg/(m2·d)],也会导致明显的骨髓抑制。这与我们的研究中涉及的微核试验和精子畸变试验是相一致的。以往的生物试验和医学试验表明[11～13]，小鼠得出的研究结果一般也适用于人类。所以，可以推断，CLO在抑制肿瘤细胞的同时，对人类的染色体及精子细胞有一定的诱变作用。这需引起人们的高度重视，有必要从多种角度对其进行安全性评估。建议长期用药时一定要注意用药剂量，安全用药。
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