研基于EFNB2 基与精神分裂症样本关联
1.引言
精神分裂症在人群中大约有1%的发病率，表现为错觉，幻觉，认知改变，情绪激动和行为异常。在已知各种致病因素中，遗传因素大约占据了80%的作用，表现为多个微效基因共同作用的结果。
许多研究都证明了染色体12q22-34 与精神分裂症之间的连锁关系。近年来，位于染色体13q33 的两个重叠基因：DAOA (D 型-氨基酸氧化酶激活剂) 和 G30, 被报道与精神分裂症显着性相关。在此后的独立的研究中，也报道了这种关联。然而，也有几项研究没能重复出这种结果。此外，还有其他几项研究表明，在这一区域可能存在不止一个易感位点。
基因Ephrin-B2 (EFNB2)位于DAOA 基因下游1Mb 处，在染色体13q33 上占据约45kb的区域。它编码酪氨酸激酶家族成员的一个蛋白质成员(ephrin)，参与调节生长发育，尤其是神经系统的发育。因此，根据其位置和功能特点，EFNB2 基因很可能是这个区域内精神分裂症的一个新的易感基因。
为了进一步研究EFNB2 基因座位在精神分裂症中的易感性，我们使用中国汉族人的病例-对照样本，在该基因所在区域选取了几个SNPs，进行遗传标记的单位点，多位点和单倍型的遗传分析。
2.材料和方法
2.1 研究对象
此研究得到地方精神病研究道德伦理委员会的支持并且得到所有研究对象的同意。
此项研究共包括846 份样本，其中477 例精神病患者(273 例男性，平均年龄为42.3?9.8岁，平均发病年龄为24.6?16.3 岁；204 例女性，平均年龄为46.0?12.6 岁，平均发病年龄为27.0?8.3 岁)和369 例正常对照(215 例男性，平均年龄为29.4?14.4 岁；163 例女性，平均年龄为29.6?14.2 岁)。由西安交通大学第一附属医院根据精神分裂症的Diagnostic andStatistical Manual of Mental Disorders (DSM-IV)标准，结合患者病例记录及临床问诊，对所有的患者进行诊断。两位资深的精神分裂症医师分别独立地对患者资料进行复核。正常对照者来自当地志愿者以及自愿献血者。全部对照者均无神经或精神方面疾病，以及家族患病史。
所有的研究对象都是汉族血统。中国医学论文网专业提供医学论文发表服务，并提供大量医学毕业论文，如有业务需求请咨询网站客服人员！
2.2 基因分型
我们在 Hapmap 数据库中选择EFNB2 基因区域的三个tagSNPs(rs9520087, rs11069646 和rs8000078)，又在NCBI 数据库中选取了rs1046775，这是在EFNB2 座位上导致组氨酸到酪氨酸的唯一一个错义突变。如图1 所示。
然而，当对这些位点进行基因分型时，我们发现rs1046755 并不具有多态性，因此该位点被排除在研究之外。最终，剩下的三个位点的跨度大约为45kb 的区域，平均间隔约为22.5kb。
我们使用等位基因特异性PCR 的方法进行基因分型，这种方法在其他研究中已有报道。PCR 引物由tetra-primer ARMS-PCR 引物设计程序设计。引物序列。
为了确定所获的基因型的正确性，我们随机选了80 个DNA 样本对这三个SNPs 再次进行基因分型。所有的基因型都与第一次的基因分型结果一致，未发现基因分型错误。
2.3 数据分析
使用 Hwsim 软件程序对三个SNPs 进行哈迪-温伯格平衡检验。对于病例-对照组，运用Epi_Info 软件程序对遗传标记的等位基因分布进行卡方检验。使用2LD 软件程序计算出D’值，以衡量两两SNPs 之间的连锁不平衡程度，从而构建单倍型。使用PHASE 程序的2.2版本模拟各种单倍型频率。Bonferroni 校正被用于进行各项统计结果的校正。使用G*Power程序进行统计效力计算，当设置参数为0.2 时（代表基因作用“微效”），当前使用的样本数量对于关联研究而言，具有89%的统计效力。
3.结果
在两组样本中，这三个SNPs 位点都具有高度的多态性。其中两个SNP (rs11069646 和rs8000078)在病例和对照中的基因型分布均符合哈迪-温伯格平衡 (P>0.05)。对于rs9520087，在对照组(P=0.018)和病例组(P=5.2x10-22)中均发现对哈迪-温伯格平衡的背离。
在 477 例中国汉族人的精神分裂症患者样本中，位于基因EFNB2 区域的3 个SNPs 的等位基因的频率，以及相对应的369 例正常对照样本的等位基因频率如表2 所示。对于遗传标记rs9520087，在病例和对照组的样本之间(X2=8.11, P=0.0044)以及两组女性之间(X2=6.97,P=0.0083)存在及其显着性差异。经过多重检验校正后，这种显着性差异仍然存在(分别为P=0.013 和P=0.025)。
近来，Zou 等人发现1）哈迪-温伯格平衡检验不能用来鉴定基因分型的错误；2）在检验等位基因与疾病的关联之前进行哈迪-温伯格平衡的验证，是不必要的甚至是有害的。相反的，应该运用趋势检验，使人们对背离哈迪-温伯格平衡的数据进行分析[33]。有鉴于此，我们重新分析了我们的数据，结果发现遗传标记rs9520087 与精神分裂症存在关联(在所有样本中XA2=6.11, P=0.0135；在女性样本中XA2=5.11, P=0.0229)。经过Bonferroni 校正，遗传标记rs9520087 仍然保持显着性差异(在所有的样本中P=0.04)。
我们在单倍型分析中，使用这三个SNPs(rs9520087, rs11069646 和rs8000078)进行构建，并且观察到了8 种单倍型，如表4 所示。我们发现单倍型的分布与精神分裂症相关(总体P=0.0065)。在病例组和对照组之间比较单倍型频率时，我们发现单倍型TTC 表现出及其显着性的差异(P=0.004)，其频率在病例组中偏高(8.85% 比5.18%)；而单倍型CTC 也显示出了显着性的差异(P=0.046)，其频率在病例组中偏低(38.17% 比42.90%)。我们进一步分析发现，单倍型TTC 在男性群体中与精神分裂症关联(P=0.029)。对上述结果，进行严格的修正(8 种单倍型和3 个等位基因的比较)后，我们发现单倍型TTC 仍然保持了显着性的差异(P=0.044)。
4.讨论
我们此次研究的目的是为了检验EFNB2 基因座位和精神分裂症之间的关系。三个SNPs位点在染色体13q33 上大约覆盖了45kb 的区域，其中包括EFNB2 基因，我们在中国汉族人的样本中对这三个SNPs 位点进行基因分型。
我们的样本中，遗传标记rs9520087 和精神分裂症之间显着相关，但对这个结果我们保持谨慎的态度，因为在我们的样本中发现遗传标记rs9520087 背离了哈迪-温伯格平衡(P<0.05)。但对于遗传标记rs9520087 的背离，至少从三个方面看来都不是一种假阳性结果。
第一，基因型频率的背离在病例组中极其显着(P=5.2x10-22)，当在对照组中则非常微弱(P=0.018)。第二，该遗传标记的等位基因频率在病例和对照组中存在极其显着性的差异(P=0.0044)。第三，经过对背离哈迪-温伯格平衡的数据的趋势校正后，遗传标记rs9520087依然显示了同疾病的显着性关联(P=0.0135)。
此外，我们还发现遗传标记rs9520087 的等位基因频率在对照组中为0.323。这与HapMap数据库中报道的0.663 存在很大的不同。这种差异可能是由于各自相对较小的样本数量引起的，即dbSNP 为84 人，我们的样本量为369 人。当前对于此现象还不能给出很好的解释，未来随着更多研究报道的出现，会有更多中国汉族人的数据报道，那时再来探讨二者的正误可能更为合适。另一个方面，尽管我们在研究中没有发现任何基因分型的错误，但是基因分型的.错误依然不能完全避免。
当然，仅仅从单个 SNP 位点分析而得到的信息是有限的。因此，为了获得更加有力的证据，我们又进行了单倍型分析。而单倍型分析是在遗传标记之间，利用连锁的有关信息进行的。
由于这三个SNP 之间不存在连锁不平衡(D’<0.5 和r2 <0.8)，我们将三个位点全部用来构建单倍型。结果显示，遗传标记rs9520087-rs11069646-rs8000078 的单倍型分布频率与精神分裂症之间显示了显着性关联(P=0.0065)。当在病例组和对照组间对每种单倍型进行比较和分析时，我们发现单倍型TTC (P=0.004) 存在很强的显着性差异，而单倍型CTC(P=0.046)也存在较弱的显着性差异。我们的结果表明，单倍型TTC 很可能是精神分裂症的一个风险单倍型。另外，遗传标记SNP rs9520087 (C to T)位于基因EFNB2 的3’-UTR 区，这表明该位点很可能参与调节EFNB2 基因的表达。而实际上，至少有两个理由可以认为3’-UTR 区在调节基因表达方面起着重要的作用：1）3’-UTR 区参与了mRNA 的3’ 末端的形成，mRNA 的稳定性和降解，以及mRNA 的亚细胞定位。研究发现3’-UTR 区是microRNA(miRNA) 的靶标序列， 而miRNA 对基因表达的调节作用主要是通过miRNA-mRNA 3’-UTR 的相互作用实现的。
目前已知，EFNB2 基因参与调节个体的生长发育，尤其是神经系统的发育。此外，谷氨酸能神经递质系统的异常在精神分裂症的发展中起着特别的作用。另一方面，EFNB2基因位于染色体13q33，该区域在精神分裂症的遗传连锁研究中恰好是一个热点区域。因此，无论从功能还是位置来讲，EFNB2 基因都是精神分裂症的一个引人注目的候选基因。
还需要指出的是，本项研究中我们在EFNB2 基因上选择了数个SNP 位点，而没有选择全部的SNP 位点。这种选择可能使这些SNP 位点的分析结果被认为不具有代表性。此外，我们从不同性别对等位基因和单倍型频率进行了分析，尽管结果显示在男性和女性中存在一定的差异，但是这种统计分析尚不足以说明与性别有关的遗传机制。
综上所述，我们的研究为EFNB2 基因与精神分裂症之间的关联提供了证据支持。由于精神分裂症和其他复杂性遗传疾病在关联研究方面的复杂模式，还需要用不同的人群样本进行更为深入和广泛的研究与验证。未来关于EFNB2 基因和其他候选基因的研究将会更好的阐明NMDA 受体途径在精神分裂症的发病机制中的作用。
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