研非复制性腺病毒携带AT2
0 引言
1975 年Kohler 和Milstein 首先报道，用细胞杂交技术，使经绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠的脾细胞，与小鼠的骨髓瘤细胞融合，并由此创建了第一个B 细胞杂交瘤细胞株，获得了抗SRBC 的单克隆抗体。他们首先创立了将能分泌特异性抗体的B 淋巴细胞同无限繁殖的骨髓瘤细胞融合技术，为单克隆抗体的制备奠定了基础。这是免疫学，乃至医学史上的一个里程碑。
单克隆抗体以特异性高、性质均一和针对特定靶点定向制备等诸多优点而广泛应用于各种疾病的治疗，特别是在肿瘤领域内的应用备受关注。美国FDA 先后批准了10 多个用于治疗肿瘤的抗体药物，都是全长抗体。虽然单克隆抗体在肿瘤治疗中发挥了重要的作用，但全长单克隆抗体治疗肿瘤成本太高：治疗肿瘤的抗体需要量极多且纯度要求高，目前的生物制药工艺难以满足市场的需求，大规模、高密度的哺乳动物细胞培养技术是目前国际上的一大难题，这些均导致高生产成本及昂贵的价格，一般患者难以承受。
因此，本课题的目的是利用非增殖腺病毒作为载体携带全长抗体基因在体内表达全长抗体，这样可以避免在体外用哺乳动物细胞表达抗体，以及纯化等复杂而且昂贵的规程。AT2是一个对肿瘤有明显疗效的抗EGFR 单克隆抗体Cetuximab。由于EGFR 在很多肿瘤中都有过量表达，在肿瘤的发生、生长、抗药性和转移性中都起到了重要的作用。Cetuximab 对过量表达EGFR 的肿瘤有良好的治疗作用，现已被批准用于头颈癌、直肠癌和肺癌的治疗，无论是单独使用还是与其它药物联合应用都有很好的效果，只有很小的副作用，出现严重反应的概率不及万分之一。Cetuximab 单抗应用其它肿瘤治疗的研究也在大力的'开发中，在肿瘤的治疗中有很大应用前景，但是由于其生产成本过高，国内普通患者难以承担，而抗体基因治疗正好解决了这个问题。本研究根据人体内密码子的偏爱性选择修改了部分氨基酸密码子，构建了修改密码子后的重组腺病毒载体。体外实验表明，通过修改密码子后提高了抗体的表达量，通过Western 和IFN 实验检验，无论修改密码子与否，重组腺病毒在293 细胞中表达的抗体与商品化的 Cetuximab 单抗相近的特性，分子量大小一致，与抗原EGFR 有很好的结合，说明我们构建的载体表达的抗体是有活性的。
1. 材料和方法
1.1 材料5 型腺病毒骨架质粒pBHGE3（加拿大Microbix Biosystems 公司），人表皮鳞癌细胞株A431、SK-Br-3 细胞和人胚胎肾细胞293 细胞(购于ATCC)，DMEM 细胞培养液，胎牛血清FBS(购于GIBCO 公司),穿梭载体pDC339 (本实验室构建)。引物和抗体基因由上海生工公司合成。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养A431 细胞、SK-Br-3 细胞和293 细胞在5%CO2，37℃ 条件下培养，培养液为含10%FBS的DMEM。
1.2.2 构建携带抗体基因重组
腺病毒载体我们首先分别合成修改密码子前后的AT2 抗体基因的轻链及重链，且在轻链及重链前面各自合成抗体的信号肽基因，用IRES 元件连接抗体的轻链和重链基因，以实现AT2 抗体的重链和轻链的平衡性及完整性，经PCR 引入酶切位点后，逐步把重轻链基因装入载体pDC339 中。
经过酶切和 PCR 鉴定后测序。PCR 鉴定穿梭载体pDC339-AT2 和pDC339-NAT2(修改过密码子)重、轻链的引物分别是GT340+GT341（轻链）、GT342+ GT343（重链）和ATNL-1+ ATNL-4（轻链）、 ATNH-1 +ATNH-4（重链）。测序正确后的穿梭载体与5 型腺病毒骨架质粒pBHGE3 利用转染试剂Lipofectamine 2000 共转染至293 细胞，通过同源重组的方法获得携带目的基因的重组病毒。共转染后9～14 d 出现病毒空斑，经过PCR 法鉴定目的基因正确后，得到表达Cetuximab 抗体的重组腺病毒载体Ad5-AT2 和Ad5-NAT2。简化示意图如下：
1.2.3 病毒扩增和纯化
病毒滴度测定重组腺病毒载体Ad5-AT2 和Ad5-NAT2 经鉴定正确后进行大扩后，用HPLC 法在纯化车间纯化，应用50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度。
1.2.4 重组腺病毒表达的抗体检测