入侵植物春飞蓬的生物检定与化学成分讨论论文
春飞蓬( Erigeron philadelphicus L. ) 为菊科( Compositae) 飞蓬属( Erigeron) 植物，又名费城飞蓬，与一年蓬( Erigeron annuus ( L. ) Pers. )的植物形态极其相似，该植物于20XX 年出现在我国浙江、福建、上海、江苏和安徽等省市，是一种源自北美的外来入侵植物。20XX 年山东境内也发现有春飞蓬，我们对其进行了初步研究。
1 实验材料、仪器与试药
1. 1 实验材料
所用实验样品于20XX 年5 月采自山东济南，经山东中医药大学生药教研室徐凌川教授鉴定为菊科飞蓬属植物春飞蓬( E. philadelphicus) L. 地上部分; 花粉粒的对照样品采自一年蓬( E. annuus ( L. ) Pers. ) 的花序，一并通过鉴定; 春飞蓬的干燥地上部分，粉粹后过40 目筛备用。
1. 2 仪器
SUPRATM55 热场扫描电子显微镜( 德国蔡司公司) ; DK-8D 型电热恒温水槽( 上海森信实验仪器有限公司) ; DYY-8 型稳压稳流电泳仪( 上海琪特分析仪器有限公司) ; YXJ-2 离心机( 湘仪离心机仪器有限公司) ;PCR 反应扩增仪( 加拿大BBI 公司) ; H6-1 微型电泳槽( 上海精益有机玻璃制品仪器厂) ; 凝胶成像系统( Gene Genius 公司) ; U-3010 紫外-可见分光光度计( 日立公司) ; Blospin 植物基因组DNA 提取试剂盒; 移液器范围( 100 ～ 1 000 mL，20 ～ 200 mL，0. 5 ～ 10 mL) ( 赛默飞世尔科技公司) ; UV-5800( 上海元析有限公司) ;Waters e2695 高效液相色谱仪( 美国沃特世公司) 等。
1. 3 试药
芦丁对照品( 批号: YM0313SA14) ; 灯盏花乙素( 野黄芩苷) 对照品( 批号: ZM0520XA14) 。亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇，所用试剂均为分析纯。
2 实验方法与结果
2. 1 基原鉴别春飞蓬为一年生或越年生草本植物。茎直立，高30 ～ 100 cm，粗壮，上部有分枝，植物密被开展长硬毛及短硬毛( 毛较多，明显) ，叶互生，基生叶莲座状，卵形或卵状倒披针形，两面被倒伏的硬毛，叶缘具粗齿，花期不枯萎，茎生叶基部半抱茎; 中上部叶披针形或条状线形，顶端尖，基部渐狭无柄，边缘有疏齿，被硬毛。头状花序数枚，直径6 ～ 8 mm，总苞片3 层，草质，披针形，长3 ～ 5 mm，淡绿色，边缘半透明，中脉褐色，背面被毛; 舌状花2 层，雌性，舌片线形，长约6 mm，平展，蕾期下垂，花期仍斜举，舌状花白色略带粉红色，管状花两性，黄色，花期为3 ～ 5 月。皮细胞及气孔2 花粉粒3 导管4 纤维5 冠毛6 花药碎片7 非腺毛8 茎部薄壁细胞( 细胞壁念珠状增厚)图1 春飞蓬粉末图Fig. 1 Powder figure of E. philadelphicus L.
2. 2 显微鉴别
2. 2. 1 粉末的显微观察黄绿色。水合氯醛加热透化装片，可见具三孔沟、近圆形的花粉粒，表面为齿状凸起，直径约为18 ～ 20 μm。非腺毛基部为2 ～ 3 个细胞并列，顶端细胞尾尖，形如刺刀。气孔椭圆形，为不定式。纤维多成束存在，壁厚。导管多为螺纹导管。茎部薄壁细胞，其壁呈念珠状增厚。
2. 2. 2 花粉粒的观察取春飞蓬与一年蓬的花粉于标本托上，喷金后分别观察两者的花粉粒。扫描电镜图显示，春飞蓬花粉粒的齿状纹饰稀疏，顶端刺渐尖，直径约为18 μm( 图2a) ; 而一年蓬的齿状凸起相对较多且花粉粒直径大，约为22 μm，齿状凸起基部膨大，顶端刺骤尖。
2. 3 分子鉴别
2. 3. 1 方法通过Blospin 植物基因组DNA 提取试剂盒来分别提取两种植物的总DNA，利用一对通用引物ITS1-ITS4进行PCR 扩增，( ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG; ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC) 通用引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 扩增反应体系: 2 × Taq mastermix 25 μL、DNA 模板4 μL、ITS1 引物2 μL、ITS4引物2 μL、ddH2O 17 μL。将反应体系中的所有成分精密移取至PCR 管中并充分混匀后放入PCR 仪中。扩增程序: 94 ℃预变性3 min，再进行35 个循环( 94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min) ，最后72 ℃延伸10 min，产物于-4 ℃冰箱保存。PCR 产物检测: PCR 产物5 μL 用3 μL EB 染色，在浓度为0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像仪照相。PCR 产物测序: 将PCR 扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序。
2. 3. 2 实验结果将本实验所得的ITS 序列输入到NCBI 上的GenBank 上Blast 后进行同源率分析，结果显示1 号与春飞蓬同源率为99%，我们可以认定为该植物即为春飞蓬; 2 号与一年蓬同源率为99%，可以判定该植物为一年蓬。故可从分子方面对两者进行区分。
2. 4 总黄酮含量测定
2. 4. 1 对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的芦丁对照品10. 0 mg，置100 mL 量瓶，加70% 乙醇定容至刻度，即得对照品溶液。
2. 4. 2 供试品溶液的制备取春飞蓬粗粉约2. 5 g，精密称定后加入14 倍量70%乙醇加热回流提取3 次( 1 h，1 h，1 h) ，3次回流后合并滤液，使其在水浴上蒸干溶剂，最后用70%乙醇定容至500 mL 量瓶中，即得。
2. 4. 3 标准曲线的.绘制精密量取芦丁对照品溶液1、2、3、4、5 mL 分别置于10 mL 量瓶，分别加入70%乙醇2 mL，精密加入5%亚硝酸钠溶液0. 3 mL，摇匀，放置6 min，精密加入10% 硝酸铝溶液0. 3 mL，混匀，放置6 min，精密加入氢氧化钠试液2 mL，摇匀，放置10 min，用70% 乙醇稀释至刻度。以相应试剂为空白，采用紫外-可见分光光度法，在510 nm 波长处测定吸光度。以芦丁对照品浓度为纵坐标( Y) ，溶液吸光度值为横坐标( X) ，作标准曲线，回归方程为Y = 0. 068 4X + 0. 002 8，R = 0. 999 9，结果表明芦丁对照品浓度在5 ～ 50 μgmL 范围内与溶液的吸光度之间呈良好的线性关系。
2. 4. 4 计算总黄酮含量根据紫外-可见分光光度法，在510 nm 波长处测定吸光度值，由标准曲线读出浓度，计算其总黄酮含量。由实验数据得出，春飞蓬中总黄酮含量约为0. 59%。
2. 5 灯盏花乙素含量测定对照品与供试品溶液均按20XX 版药典方法制备，按照20XX 版中国药典灯盏花乙素含量测定方法测定，结果未测出灯盏花乙素。
3 讨论
春飞蓬原产北美，是一种外来入侵植物，最近几年在中国南方城市发现，但在山东境内发现属首次报道。因其植物形态与一年蓬极近似，常会被误认为一年蓬。可先从形态特征如叶先端的形态、花的开放特点和花期以及毛茸等几个方面仔细加以区别。再者可以通过分子鉴定方法进一步区别。通过对春飞蓬进行初步鉴定研究，表明其粉末中主要显微特征有花粉粒、多细胞非腺毛、螺纹导管、表皮细胞及不定式气孔、纤维、冠毛、花药碎片和茎部薄壁细胞等; 从花粉粒扫描电镜图可以看出，春飞蓬花粉粒比一年蓬花粉粒的直径小，且外壁纹饰的齿状突起更稀疏、更短钝; 得到了春飞蓬的ITS 序列; 紫外-可见分光光度法测得春飞蓬全植株中总黄酮含量为0. 59%; 灯盏花乙素未检测出。资料报道全世界飞蓬属植物种类共计200 余种，其中经过研究的有30 多种，我国对飞蓬属植物研究较深入的只有短亭飞蓬( Erigeron breviscapus( Vant. ) Hand. Mazz. )，对同属其他植物的研究均较少且不深入，总体看来，该属植物大多含有黄酮、甾醇、萜类、挥发油和咖啡酞类等化合物。本实验说明春飞蓬含有黄酮类化合物，有理由推测其具有一定的资源利用价值，有必要对其开展较系统的化学成分、药理等方面的研究。
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