浅谈珙桐种群繁衍多样化与分子地理学分析
1.1珙桐概述
珙桐(Davidia imolucmte Baill),又名水梨子、鹤子树，系我国特有的落叶乔木，仅有1种和1变种，即琪桐和光叶珙桐。琪桐的叶面鲜绿色，起初叶腹面有柔毛，后期较平滑，叶背面密生淡黄色粗毛，光叶琪桐的叶腹面无毛，或者叶嫩时叶脉上有稀疏的短软毛，有时腹面被白霜。珙桐是由法国传教士和博物学家David于1869年在四川穆坪(今四川宝兴县)首次发现的之后很多国家和地区先后进行引种，现在瑞士日内瓦、美国白宫和英国等国家均有珙桐分布,其已经适应了当地的环境，成为世界上著名的园林观赏植物。琪桐起源古老，目前面临着生存的危机，现国家已将其列为一级保护珍稀植物范围，同时也成为世界著名的木本观赏花齐植物。第四纪冰期后，当时的很多植物遭受灭绝。但由于我国地势复杂，从而成了各种植物的天然避难所，琪桐即在我国中、西南部偏僻的山区幸存下来，目前珙桐仅天然分布在甘肃、陕西、湖北、湖南、四川、云南、贵州等7省40多个县，分布范围较窄，资源量较少，仅限于一些边远山区人迹罕至之处，所以植物学家又称其为“林海中的珍珠”、“植物活化石”和“绿色熊猫”。也因为洪桐的以上特征，其对植物区系、植物系统发育及地史变迁的研究具有很高的'科学价值。
琪桐除了具有科学价值外，其价值还主要体现在花上，其花色纯白，属于顶生头状花序，花序下面有两个白色大荀片，远看形似一群白鹤息于绿荫丛中，由此，人们称其为“鹤子树”。另外，珙桐具有很大的经济价值，主要体现在琪桐的种子、果皮、花、树皮和果皮上，例如琪桐的花是蜜源，种子和果皮都能榨油，琪桐作为木材是建筑、家具等优质材料等，此外，洪桐还具有重要的药用价值，比如珙桐叶片中含有可以祛痰止咳、抗肿瘤、抗衰老、增强免疫力等作用的黄酮类化合物，其中起到关键作用的是黄酮化合物中的一种有效成分槲皮素。目前，学者们对于琪桐的研究还不全面，尤其是在分子方面。下面介绍一下琪桐的研究概况。
1.2琪桐研究概况
自1869年首次发现琪桐至今已有一百四十多年的历史，而我们对琪桐的研究始于20世纪70-80年代。目前，珙桐的濒危形势日趋严峻，主要表现为珙桐的天然分布范围逐渐缩小，片段化现象也日益明显。张清华等认为，到2030年，单就气候变化对于珙桐的影响，即可使珙桐的分布面积大大减少，约减少现在的20%，分布越来越零碎。珙桐种群繁衍多样化与分子地理学分析，因此，保护琪桐，挽救这一濒危物种，已是迫在眉睫。有关方面也早已意识到这个问题的严重性、紧迫性，近二十多年来，珙桐已引起人们的高度重视和广泛关注，至今对琪桐的研究主要体现在以下几个方面。
1.2.1琪桐生物学特性
琪桐为高大落叶乔木，一般高达10?25 m，少数达30m以上，胸径1.0-1.5 m。当年生枝紫绿色，多年生枝深褐色或深灰色，树皮灰黄色，粗糖呈不规则片状脱落，树冠圆锥形。单叶互生，叶成心形或阔卵形，长9-16cin,叶顶部短尖，叶底部呈心形，边缘有粗大的据齿，且具有剌状的尖突，叶背面呈鲜绿色，叶柄长4-8 cm，常有灰色的续毛。琪桐属于两性花或者雌雄花同株植物，头状花序，花底部生有长卵圆形夜片2-3枚，荀片形成之初为淡绿色，随后为乳白色，荀片快要脱落时变为棕色。琪桐的雄花无花被，子房下位，4-10室。哄桐是浅根性树种，无明显的主根，侧根发达，毛细根特别多，从而形成了庞大的侧根系。琪桐果实为核果，外果皮薄，中果皮厚，内果皮坚硬，木质化，构成果核，果核具有沟纹，内含3-5粒种子，种皮较薄紧贴着内果皮。琪桐的种子为双子叶有胚乳种子，有胚芽、胚轴、胚根、子叶等胚的4个组成部分组成，子叶宽大肥厚。每年3月琪桐叶芽开始萌动，3月底或4月初孕蕾，初花期为4月20日左右，盛花期为5月上旬，末花期为5月20日左右，花期30d左右。幵花初期，2个荀片直立向上生长，其中1个生长较快，另一个较慢。10-15 d后荀片脱落，5月下旬幼果逐渐形成，10月下旬果实成熟并开始脱落，11月下旬全部脱落。珙桐的主要生长期为3?6月，其从幼树到开花时间为6-10年。
2材料与方法
2.1材料与仪器、试剂
本研究于2011年7月，完成了湖南、湖北、四川、贵州四省11个代表性天然琪桐种群的样品采集(见表1)。每个种群采集20株以上的个体，为了防止采集到同一个母株后代的植物，保持单株之间距离50m以上，共采集240株个体。采样遵循以下原则(1)全部选取野生的自然种群;(2)样品具有代表性，尽可能的覆盖其分布的地理区域。野外采集的琪桐新鲜嫩叶立即放入装有桂胶的密封袋中，记录各种群的地理位置及个体数。带回实验室后，将叶片放入-7(rc的冰箱中保存备用，并制作种群凭证标本。标本保存于中南林业科技大学林木遗传育种实验室。
3 结果与分析......................... 33-48
3.1 珙桐基因组DNA的提取和检测......................... 33-34
3.1.1 珙桐基因组DNA的电泳检测......................... 33
3.1.2 珙桐基因组DNA的核酸蛋白分析检测......................... 33-34
3.2 珙桐ISSR分子标记结果与分析 .........................34-44
3.2.1 ISSR部分引物的初筛及退火温度的确定......................... 34
3.2.2 ISSR反应体系的单因素优化......................... 34-38
3.2.3 ISSR反应体系的正交设计优化 .........................38
3.2.4 ISSR最佳反应体系及程序确定............
............ 38
3.2.5 珙桐ISSR引物筛选与退火温度确定 .........................38-41
3.2.6 珙桐遗传多样性的ISSR分析 .........................41-44
3.2.6.1 ISSR-PCR扩增片段多态性......................... 41
3.2.6.2 种群多态性......................... 41-42
3.2.6.3 种群遗传分化......................... 42-44
3.3 珙桐cpDNA非编码序列标记结果与分析......................... 44-48
3.3.5 单倍型的系统发育分析 .........................47-48
4 结论与讨论......................... 48-52
4.1 珙桐ISSR种群遗传多样性结论与讨论 .........................48-49
4.1.1 珙桐种群遗传多样性......................... 48
4.1.2 珙桐种群遗传结构......................... 48-49
4.2 珙桐cpDNA非编码序列结论与讨论......................... 49-51
4.3 珙桐遗传资源保护......................... 51-52
结论
基于珙桐的ISSR分子标记和叶绿体DNA非编码序列标记研究，通过分析拱桐的遗传多样性和分子谱系地学，为琪桐的遗传资源保护提供了一定的信息。遗传多样性是物种适应外界环境变化的进化潜力基础，遗传多样性丢失将大大降低个体的适应度和物种应对环境变化的适应能力。琪桐物种和种群维持较高水平遗传多样性，种群间产生较大遗传分化，表明种群内个体间杂交不可能导致近亲衰退，物种具有较大的进化潜力。
据此，建议尽可能地保护琪桐所有的天然种群原生境条件，禁止滥砍滥挖，以保护尽可能多的遗传变异。其中，优先保存四川峨眉山、湖南桑植和贵州梵净山等遗传多样性丰富度高的种群。由于珙桐天然更新困难，应积极开展琪桐天然林人为促进更新措施。琪桐为世界著名的观赏木本植物，种苗具有很高的商业价值，但其对生境要求严格，自行繁殖困难很大,引种人工林中开花结实植株不多。因此，应加强珙桐引种驯化和人工繁殖技术研究，这不仅能缓解琪桐天然种群由于自身繁殖能力不足以及人为采挖造成对其生存的威胁，而且可以确保异地引种人工林开花结实，可持续生存繁殖。
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