新型反相限进材料对蛋白质的排阻特性分析论文

时间:2018-08-05 12:42:28 材料毕业论文 我要投稿

新型反相限进材料对蛋白质的排阻特性分析论文

  摘要:以溴代硅胶为引发剂,CuBr/2,2-联吡啶为催化体系,在改性硅胶上经二步表面引发原子转移自由基聚合(SI-ATRP)制备内表面接枝甲基丙烯酸十八烷基酯(C18)、外表面接枝甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)、水解得到表面含大量二醇基的新型反相限进材料。使用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、元素分析和热重分析(TGA)对其表征,采用静态吸附实验研究反相限进材料的吸附性能,其对磺胺二甲氧嘧啶和土霉素的最大吸附量分别为 18. 02 和 4. 80mg / g.结合固相萃取(SPE)评价其对大分子蛋白质的排阻性能,以牛血清白蛋白(BSA)作为排阻大分子模型,排阻能力达 90%.将其用于牛奶中土霉素的分离富集,经高效液相色谱(HPLC)检测,土霉素的平均加标回收率为89. 19% ,相对标准偏差为 3. 03% .有望将新型反相限进材料和 HPLC 或液相色谱-质谱(LC-MS)等分析系统结合应用于生物样品的处理和检测。

新型反相限进材料对蛋白质的排阻特性分析论文

  关键词限进材料;表面引发原子转移自由基聚合;牛血清白蛋白;磺胺二甲氧嘧啶;土霉素;牛奶。

  Abstract:A novel reversed phase restrict access material was prepared via two steps of sur-face-initiated atom transfer radical polymerization (SI-ATRP)。 The stearyl methacrylate (C18)and glycidylmethacrylate (GMA)were grafted on inner and outer surfaces of modified silica,allowing brominated silica and CuBr / 2,2-pyridine to serve as macro-initiator and catalyst sys-tem. After hydrolysis,we got a hydrophilic reversed phase restrict access material with rich gly-col group, which was characterized by Fourier transform infrared (FT-IR ) spectrum,elementary analysis and thermogravimetric (TGA)analysis. The static adsorption experimentwas employed for evaluating the binding capacity of the novel reversed phase restrict accessmaterial. The maximum adsorption amounts of sulfadimethoxine and oxytetracycline were18. 02 and 4. 80 mg / g,respectively. The properties of material for the exclusion of proteins likebovine serum albumin (BSA)were evaluated using solid-phase extraction (SPE)and its exclu-sion value up to 90%. The novel reversed phase restrict access material was used for the separa-tion and enrichment of oxytetracycline in milk. The high-performance liquid chromatography(HPLC)was used to detect the oxytetracycline and the average recovery was 89. 19% with therelative standard deviation (RSD)of 3. 03%. It is expected that the novel inversed restrictaccess material combined with HPLC or liquid chromatography-mass (LC-MS)analysis systemis applied to the extraction and detection of biological samples.

  Key words:restrict access material;surface-initiated atom transfer radical polymerization.

  表面引发原子转移自由基聚合(surface-initiated atom transfer radical polymerization,SI-ATRP)是一种强大且灵活的合成技术,其适用的单体范围广,反应条件温和,分子设计能力强,可合成预定结构和序列的聚合物[1-3].Wang 等[4]通过反 ATRP 技术制备手性整体固定相,以 β-环糊精(β-CD)作为手性选择剂,采用 ATRP 技术在表面接枝亲水聚合物刷来提升柱的生物兼容性,将此材料结合 HPLC 检测血浆中的手性药物。Lv 等[5]通过逐层修饰成功制备了限进介质分子印迹磁性微球,用于磁性微萃取牛奶中的双酚 A,此限进介质分子印迹磁性微球选择性高,避免了生物样品中蛋白质在微球表面的沉积。

  限进材料是 20 世纪 80 年代[6,7]发展起来的一种用于生物样品直接进样的固相萃取材料。最初,Boos 等[8-10]提出烷基-二醇基限进材料(alkyl-diol-silica,ADS),并结合 HPLC 检测血浆、尿液等样品中的药物分子。喻昕等[11]提出了一种制备 ADS 固定相的改进方法。限进材料提供了以下优势[12-14]:第一,材料的亲水性外表面可以防止样品基质中的蛋白在表面发生不可逆吸附,延长使用寿命,减少成本;第二,材料内表面的配体可以变换不同的基团种类,如 C4、C8、C18或离子交换官能团等;第三,将新型材料与简便、多样及相容性较高的 HPLC 或 LC-MS 等分析系统相结合[15-17],为生物样品中药物残留检测提供了一条非常有前景的发展途径。Wang等[18]把 β-环糊精固定在硅胶内部,构建手性结合层,再通过 SI-ATRP 反应把甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝到表面,用该手性限进材料检测并拆分生物样品中的扁桃酸和氯噻酮。Wang 等[19]在硅胶表面引入十八烷基链和苄基氯,通过 SI-ATRP 接枝甲基丙烯酸环氧丙酯,水解得到表面含二醇基的反相限进材料,用于牛奶中邻苯二甲酸酯类物质的分离富集,但接枝十八烷基链没有采用 SI-ATRP 技术,以致单体接枝不够均匀,接枝密度不够高。

  甲基丙烯酸十八烷基酯[20]是具有 18 个碳的直链烷烃,但将其应用于限进材料的制备未见报道。近年来已有将 ATRP 技术用于制备限进材料的文献,但功能单体接枝量和接枝密度都有待提升。本文通过二步 SI-ATRP 技术在硅胶表面接枝两种不同的功能单体,接枝量高,接枝密度大。新型反相限进材料外表面的亲水层有效避免样品基质的干扰,对小分子具有萃取能力,但选择性不够高,有待继续研究。最后以新型反相限进材料为萃取基质,结合HPLC 检测牛奶样品中的土霉素(OTC)。

  1 实验部分。

  1.1 仪器、试剂与材料。

  LC-20AT 高效液相色谱仪、傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津公司),TU-1810 紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司),Vario ELII元素分析仪(德国 Elementar 公司)。

  100 ~ 200 目硅胶(青岛海洋化工有限公司);甲基丙烯酸十八烷基酯(纯度 96%,含质量分数为0. 01% 的氢醌-甲基醚稳定剂)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA,纯度 97%)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(纯度 98%)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM,纯度 99%)、OTC(纯度 99%)、CuBr(化学纯)、2,2-联吡啶(纯度99% )、2-溴异丁酰溴 (纯度 97% )、牛血清白蛋白(BSA,纯度 98%)(上海晶纯试剂有限公司);浓盐酸、浓硫酸、异丙醇、甲醇、三乙胺、乙二胺四乙酸二钠、四氢呋喃、甲苯均为分析纯(天津市大茂化学试剂厂);牛奶(购于当地超市,宁夏夏进乳业集团股份有限公司)。其他试剂均为国产分析纯。

  1.2 新型反相限进材料的制备过程。

  1.2.1 氨丙基硅胶(Silica-NH2)的制备。

  称取 10. 0 g 硅胶置于 250 mL 圆底烧瓶中,加入 100 mL 20% (体积分数)盐酸,超声分散均匀,于110 ℃ 油浴中回流 8 h.水洗至中性,用乙醇和丙酮各洗 3 次,于 120 ℃真空干燥。取 3. 0 g 活化硅胶置于圆底烧瓶中,加 50 mL 无水甲苯,超声分散均匀。在 N2保护下缓慢滴加 5. 20 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷,于110 ℃反应24 h.用甲苯、丙酮各洗3 次,于 60 ℃ 真空干燥,即得到 Silica-NH2.

  1.2.2 2-溴异丁酰溴氨丙基硅胶(Silica-Br)的制备。

  冰浴条件下,将 3. 0 g 氨丙基硅胶分散于 30mL 无水四氢呋喃中,搅拌 1 h,加入 2. 3 mL 三乙胺,再逐滴加入 1. 5 mL 2-溴异丁酰溴,混合物在0 ℃ 下搅拌 30 min,室温反应 24 h.用四氢呋喃、甲醇和水依次洗涤,于 60 ℃真空干燥,即得到 Silica-Br.

  1.2.3 釆用 SI-ATRP 在硅胶内表面接枝甲基丙烯酸十八烷基酯。

  圆底烧瓶中加入 3. 0 g 溴代硅胶作为引发剂,加入 143 mg CuBr 和 312 mg 2,2-联吡啶。另一圆底烧瓶中加 20 mL 无水甲苯和 20 mL 甲基丙烯酸十八烷基酯,采用真空惰性气体操作管线装置,充氮除氧 30 min,在 N2保护下于 60 ℃反应 24 h,分别用异丙醇、二次蒸馏水、0. 2 mol/ L 乙二胺四乙酸二钠水溶液、水和乙醇洗涤,于 60 ℃真空干燥,即得到Silica-Br-C18.

  1.2.4 釆用 SI-ATRP 在硅胶外表面接枝 GMA 链。

  圆底烧瓶中加入 3. 0 g 接枝 C18的溴代引发剂硅胶、0. 40 g CuBr 和 1. 28 g 2,2-联吡啶。另一圆底烧瓶加入 100 mL 异丙醇和 10 mL GMA,超声分散均匀。采用真空惰性气体操作管线装置,充氮除氧 30 min.在 N2保护下于 40 ℃反应 24 h,通入空气终止反应,依次用异丙醇、甲醇、水、0. 2 mol/ L 乙二胺四乙酸二钠水溶液、水和丙酮洗涤,于 60 ℃真空干燥,即得到 Silica-Br-C18-GMA.

  1.2.5 GMA 链水解。

  所得产物(Silica-Br-C18-GMA)置于 100 mL 圆底烧瓶中,加入 60 mL 0. 1 mol/ L 硫酸,60 ℃水解12 h,反应完毕后,水洗至中性,于 40 ℃ 真空干燥,即得到新型反相限进材料(Silica-Br-C18-GMMA)。

  1.3 Silica-Br-C18-GMMA 限进行为的评价。

  为体现新型反相限进材料的限进特点,选择BSA 作为排阻蛋白质大分子模型来评价其外表面的亲水性特点。BSA 是相对分子质量约为 68 kDa的疏水性蛋白质,经常用于模拟生物环境实验。选择结构不同的 SDM 和 OTC 作为小分子模型(见图1)来评价其内表面十八烷基链的萃取能力,通过静态吸附实验研究该新型反相限进材料对小分子的萃取能力。

  1.3.1 Silica-Br-C18-GMMA 对 BSA 的排阻。

  在 6 mL 固相萃取(SPE)小柱内分别填充 200mg Silica-Br-C18-GMMA 和 200 mg Silica-Br-C18,使柱床体积为 2 mL,柱上下两端用多孔性的聚四氟乙烯筛板,使小柱装填均匀且空隙较少。装填完成后,用 1 mL 甲醇和 3 mL 水平衡小柱,注入 3 mL 1g / L BSA 溶液,收集流出液,用紫外分光光度计在280 nm 处检测不保留的 BSA 的吸光度。再用 2mL 水淋洗,用 2 mL 甲醇洗净小柱。

  1. 3. 2 Silica-Br-C18-GMMA 对 SDM 和 OTC 的吸附。

  取 20 mg Silica-Br-C18-GMMA 于 50 mL 具塞锥形瓶中,以甲醇为溶剂分别配制一系列不同质量浓度的 SDM 和 OTC 溶液,25 ℃下振荡吸附 12 h,离心,取上清液过 0. 45 μm 滤膜,用紫外分光光度计在270 nm 处检测溶液中的 SDM,在365 nm 处检测溶液中的 OTC,重复实验 3 次。根据吸附前后溶液中质量浓度的变化,计算出该新型反相限进材料对 SDM 和 OTC 的平衡吸附量。平衡吸附量按公式(1)计算:

  (1)。

  其中,Q 为吸附量(mg/ g),Co和 Ce分别为初始浓度和平衡浓度(g/ L),V 为溶液体积(mL),m 为反相限进材料的质量(g)。

  1.4 实际样品测定方法。

  1.4.1 样品处理。

  取 10. 0 mL 牛奶样品置于 50 mL 离心管中,加入一定量 OTC,加 20 mL 乙腈,振荡混合均匀,超声20 min,以 4 000 r / min 的速度离心 10 min,上清液过 0. 22 μm 滤膜,备用。

  准确配制一系列质量浓度为 4 ~ 10 mg/ L 的OTC 标准溶液。牛奶样品中 OTC 加标量分别为 3、5 和 9 mg / L,以新型反相限进材料作为萃取基质对样品进行分离纯化,用 HPLC 检测牛奶中 OTC 的含量。

  1.4.2 色谱条件。

  色谱柱:Diamonsil C18柱(150 mm×4. 6 mm,5μm);流动相:质量分数为 0. 1% 的乙酸铵水溶液-乙腈(87 ∶ 13,v/ v);检 测 波 长:353 nm;流 速:1mL / min;进样量:20 μL.

  2 结果与讨论。

  2.1 新型反相限进材料的制备。

  新型反相限进材料采用二步 SI-ATRP 技术在硅胶内外表面分别接枝甲基丙烯酸十八烷基酯和GMA 链,合成路线见图 2.以硅胶为基质,表面引入氨基后,与 2-溴异丁酰溴反应得到溴代引发剂硅胶。选择 CuBr/2,2-联吡啶为催化体系,甲基丙烯酸十八烷基酯和 GMA 分别为功能单体,分别在无水甲苯和异丙醇中进行二步自由基引发聚合,水解得到表面含二醇基的一种新型反相限进材料。得益于 SI-ATRP 技术,新型反相限进材料的疏水层和亲水层接枝均匀,两种功能单体接枝密度高,提高了对小分子的萃取能力和排阻蛋白质的能力。

  2.2 新型反相限进材料的表征。

  2.2.1 红外光谱分析。

  红外光谱常用来鉴定样品表面所含有的功能基团。图 3 是 Silica-Br、Silica-Br-C18、Silica-Br-C18-GMA 和 Silica-Br-C18-GMMA 的红外光谱图。808cm-1为 -C-Br 的伸缩振动峰,证实溴代引发剂硅胶已制备成功。1 102 cm-1为 -C-O 的伸缩振动峰,1 736 cm-1为 -C=O 的伸缩振动峰,2 856 cm-1为-CH2的不对称伸缩振动峰,2 929 cm-1为 -OH 的伸缩振动峰。对比图 3 中曲线 b、c 和 a 可看出,-C-O 的伸缩振动峰、-C=O 的伸缩振动峰和 -CH2的不对称伸缩振动峰增强,说明通过二步 SI-ATRP反应,活性自由基 Br·成功引发单体聚合,使甲基丙烯酸十八烷基酯和 GMA 这两种单体成功接枝到硅胶表面。对比图 3 中曲线 c 和 d,-OH 的伸缩振动峰也明显增强,说明环氧基开环成功。

  2.2.2 元素分析。

  对 Silica-Br、Silica-Br-C18和 Silica-Br-C18-GMMA进行元素分析,分析数据见表 1.经二步 SI-ATRP反应后,Silica-Br-C18-GMMA 与 Silica-Br 相比,C 元素含量由 10. 1% 增至 33. 71%,H 元素含量由 1. 88% 增至 4. 95%,充分说明甲基丙烯酸十八烷基酯和 GMA 成功接枝到硅胶表面。

  2.2.3 热重分析。

  热重分析是测定表面修饰聚合物接枝量的重要手段[21],图 4 是 Silica-Br、Silica-Br-C18和 Silica-Br-C18-GMMA 的热重分析图。Silica-Br 在 29 ~ 270 ℃时失重百分比为 8. 03%,主要由 3-氨基丙基三乙氧基硅烷和 2-溴异丁酰溴的热分解造成。Silica-Br-C18在 26~260 ℃和 220~800 ℃时失重百分比分别为 4. 82% 和 28. 20%,与 Silica-Br 相比,失重相对较大,这是由交联剂和接枝到硅胶内表面的甲基丙烯酸十八烷基酯的损失造成。Silica-Br-C18-GMMA 在160 ~ 787 ℃ 时失重最大,失重百分比为 55. 49% ,这主要是甲基丙烯酸十八烷基酯和 GMA 链的损失所致。由此可证实两种单体成功接枝在硅胶表面。

  2.3 新型反相限进材料分离的富集性能。

  2.3.1 Silica-Br-C18-GMMA 对 BSA 的排阻性能。

  相同条件下,Silica-Br-C18和 Silica-C18-GMMA的蛋白质排阻回收实验数据见表 2.Silica-Br-C18通过 SI-ATRP 反应在硅胶表面只接枝 C18烷基链,疏水性较强,与 BSA 通过静电作用结合,其结合BSA 的量为 22. 9%.Silica-C18-GMMA 与 BSA 的结合量为 12. 4%,低于 Silica-Br-C18,这是因为该材料外表面的二醇基具有亲水性,对 BSA 具有屏蔽作用,使其不能进入内表面,说明新型反相限进材料对BSA 具有排阻能力。

  2.3. 2 Silica-Br-C18-GMMA 材料对 SDM 和 OTC的吸附能力。

  以 SDM 和 OTC 作为小分子模型,研究 Silica-Br-C18-GMMA 对小分子的吸附性能,结果见图 5.随着 SDM 初始浓度的增大,吸附量逐渐增大,当浓度大于 0. 9 mmol/ L 后趋于吸附平衡,最大吸附量为 18. 08 mg/ g.随着 OTC 初始浓度的增大,吸附量逐渐增大,当浓度大于 0. 15 mmol/ L 后,吸附量基本保持不变,最大吸附量为 4. 4 mg/ g.Silica-Br-C18-GMMA 材料内表面键合非极性的十八烷基链,与 SDM 和 OTC 的`相互作用主要是疏水作用。从二者结构看,OTC 中含有 6 个羟基,极性大于 SDM,所以 OTC 的疏水作用小于 SDM,故 SDM 的吸附量大于 OTC 的吸附量;从空间位阻看,可能由于限进材料外表面具有大量羟基,分子量小的 SDM 更容易进入内表面与十八烷基链产生相互作用。SDM 和OTC 在新型反相限进材料上都有一定量的吸附,证明新型反相限进材料除了外表面具有亲水的二醇基之外,其内表面的 C18链具有萃取小分子物质的能力,体现出新型反相限进材料的双官能团特点。

  2.4 实际样品的测定。

  用 HPLC 检测处理过的牛奶样品,结果未检测到 OTC.以新型反相限进材料为萃取基质,进行OTC 加标回收试验。

  使用新型反相限进材料结合 HPLC 分离富集并检测牛奶样品中的 OTC.图 6a 为 9 mg/ L OTC 标准溶液的色谱图,出峰时间为 9 min;图 6b 为牛奶加标 OTC(9 mg/ L)样品经新型反相限进材料处理的液相色谱图;图 6c 为牛奶空白样品。以 OTC 的峰面积 y 对质量浓度 x(mg/ L)做标准曲线,线性方程为 y=15. 907x-41 617,相关系数为 0. 992 7,表明OTC 在对应的 4 ~ 10 mg / L 范围内具有良好的线性关系。OTC 的平均加标回收率为 89. 19%(n = 3),其 RSD 为 3. 03%.

  3 结论。

  本文采用二步 SI-ATRP 技术将甲基丙烯酸十八烷基酯和 GMA 键合到硅胶表面,制得新型反相限进材料。傅里叶变换红外光谱分析、元素分析和热重分析数据均表明两种功能单体接枝成功。考察新型反相限进材料结合固相萃取小柱对蛋白质大分子的排阻性能,通过对比发现其对蛋白质的排阻效果良好;通过吸附实验发现其对结构不同的小分子物质具有一定的吸附能力,说明内表面的十八烷基链具有萃取能力。该材料作为吸附剂,用于分离富集牛奶样品中的 OTC,效果良好。该新型反相限进材料有望应用于含有白蛋白、免疫球蛋白或血纤维蛋白原等大量蛋白质的复杂生物样品的前处理和药物小分子的检测。

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