纳米材料在蛋白磷酸化分析中的应用论文

时间:2020-12-07 14:53:26 材料毕业论文 我要投稿

纳米材料在蛋白磷酸化分析中的应用论文

  蛋白质是生理功能的执行者,是生命物质的基础,对蛋白质结构和功能的研究是生命科学研究中的重点。翻译后修饰是调节蛋白质功能的重要方式,对其的研究对于阐明蛋白质的功能具有重要作用。蛋白磷酸化是蛋白质翻译后修饰的一种,是在ATP存在下,通过蛋白激酶催化ATP 位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸上的过程。其在胚胎发育、细胞增殖、新陈代谢、细胞信号传导方面具有重要的调节作用,是生物体中常见的调节方式。当其调节发生异常时,会导致癌症、心脏病等疾病的发生。因此,对蛋白磷酸化的研究有助于更好地了解细胞的信号通路过程,有利于疾病的诊断和治疗。然而,由于磷酸化肤段在生物样品中的含量较低且易受到非磷酸化肤段的干扰等主要缺点的存在,为检测工作带来很大的困难。因此,克服以上瓶颈和困难,实现蛋白磷酸化的高灵敏检测,对于疾病早期快速诊断具有非常重要的意义。目前,蛋白磷酸化的检测方法主要有:放射性检测、荧光法、表面等离子体共振、质谱、电化学、WesternBlot及ELISA等。近年来,随着纳米技术的快速发展,将纳米技术运用于蛋白磷酸化的高灵敏分析受到越来越多的重视。

纳米材料在蛋白磷酸化分析中的应用论文

  纳米材料按照结构可分为:零维纳米材料(包括金属纳米粒子、量子点和磁性纳米粒子等)、一维纳米材料(如碳纳米管等)、二维纳米材料(典型代表是石墨烯)。因纳米材料大的比表面积、丰富的键合位点、良好的生物相容性和催化活性以及独特的结构,为高灵敏、高选择性生物分析提供了动力,在DNA分析酶传感、生物小分子的检测等领域被广泛应用,同时也为蛋白磷酸化分析带来新的机遇。

  本文基于选择性识别或捕获磷酸化的肤段或蛋白的主要机理,综述了近几年纳米材料在磷酸化肤段的富集和信号放大方面的应用,及其在高灵敏蛋白磷酸化分析中的研究进展并进行了展望。

  1磷酸化肤段或蛋白的富集及信号放大机理

  1。 1基于纳米材料的富集机理

  为排除非磷酸化的肤段或蛋白的干扰,选择性识别或捕获磷酸化的肤段或蛋白是非常重要的一步。利用纳米材料选择性富集磷酸化的多肤或蛋白的常见方式是通过化学亲和作用,一种是采用金属氧化物作亲和探针,其中金属氧化物的路易斯酸度是影响金属氧化物亲和性的主要因素

  ①具有最强酸度的金属氧化物,因可与非磷酸化多肤键合,致使检测存在着很严重的非特异干扰。

  ②具有较强酸度的金属氧化物对磷酸化肤存在强的键合力,因为多磷酸化肤不易洗脱,致使优先检测单磷酸的多肤。

  ③具有较低酸度的金属氧化物因与单磷酸化肤弱的相互作用,可选择性地亲和多磷酸化的肤。另一种是金属离子与磷酸根的作用。关于金属离子与磷酸根的相互作用存在着争议,有文献认为金属离子与磷酸根是静电吸附作用,而有的文献则认为它们之间作用力的强度远大于静电作用。

  1。 2基于纳米材料的信号放大机理

  近几年,信号放大技术尤其是基于纳米材料的信号放大在磷酸化的超灵敏检测中受到了广泛关注。如何既能选择性识别磷酸化肤段或蛋白,又能结合信号放大部分,以实现磷酸化肤段或蛋白检测信号的放大是其关键步骤。较常用的识别或连接方式主要有两类:①生物亲和作用,②化学键合作用。而基于纳米材料信号放大的机理主要归于以下两个方面:①纳米材料作载体。因为纳米材料独特的生物相容性和大的比表面积以及易于修饰的特性,使其非常有利于用作载体以增强探针的量。通常纳米材料作为一个基底元素用来富集目标分子或信号分子,以实现信号的放大。②增强导电性。一般纳米材料的导电性比较优越,因此可加快电子传递的速率,提高信号响应。

  2基于纳米材料对磷酸化肤段或蛋白的预富集

  由于非磷酸化多肤的干扰和磷酸化多肤本身的丰度低等问题,导致研究者对蛋白磷酸化位点的鉴定和分析存在很大的困难。因此,对磷酸化的肤段或蛋白进行选择性富集,以提高磷酸化组分的相对含量,降低非磷酸化组分的干扰显得十分重要。纳米材料及其复合物因为价格低,纳米表面易于功能化,与磷酸化肤之间的结合力强,而被广泛用于蛋白磷酸化的富集和分离。

  2。 1介孔纳米材料

  近几年,介孔材料在纳米科学领域中占据重要的地位,基于其独特的微纳米尺寸效应,如大的比表面积、多孔结构等,介孔材料被应用于不同的生物领域。

  金属氧化物纳米粒子因独特的表面效应、超顺磁性、小尺寸效应和量子隧道效应等特性,使其表面易于富集磷酸化多肤。早期的研究主要是将单一的纳米金属氧化物填充在柱体中或移液器吸头内进行磷酸化肤段的预富集。2009年,Ge等首次将制备的介孔二氧化错纳米材料用于高效选择性富集磷酸化的肤段。与纳米金属氧化物材料相比,介孔纳米材料因其超大比表面积以及许多活性位点,而具有更强的键合磷酸根的能力。随后,介孔二氧化钦和介孔二氧化铅纳米材料也被用于磷酸化肤的富集。研究表明,介孔二氧化铅和二氧化错在复杂样品中富集磷酸化肤段的能力优于介孔二氧化钦纳米材料。虽然,介孔金属氧化物纳米材料在富集磷酸化多肤方面优于金属氧化物材料,但其过深的孔道结构可能导致目标多肤富集和释放困难。

  在己报道的富集技术中更倾向于单磷酸化肤段的富集,而导致多磷酸化肤段的信息丢失,不利于对其全面的了解和研究。针对这个问题。用ZrP修饰的介孔硅材料选择性捕获磷酸化的肤段并运用质谱进行分析。该材料因表面与多磷酸化肤段的结合力更强而优先富集多磷酸化的肤段。刘宝红课题组也将功能化的介孔材料应用于多磷酸化肤的富集,发展了新型的针对多磷酸化肤段的富集方法,该研究组用湿润注入法在硅介孔材料表面修饰二氧化钦,制备了一种基于二氧化钦修饰的介孔硅材料。介孔材料大的.比表面积及其良好的微纳尺寸效应,加快了溶液体系中介孔材料和多肤之间的吸附。同时又因为二氧化钦修饰于介孔材料之后,在其表面形成大量的不饱和的4配位钦物种,易与磷酸基团形成双齿鳌合,且更倾向于发生在多磷酸化肤段中,使多磷酸化肤段优先选择吸附,检测信号显著提高。该研究组还构建了一种微纳反应器,先制备大孔有序的氧化铝功能化的氧化硅泡沫材料,然后将蛋白酶固定在该泡沫材料上,该反应器己被应用于磷酸化多肤的分析。具有大的孔径和比表面积,既可实现原位酶解又可发生原位磷酸化。将A1 — MOSF直接加入到溶液中时,酶和蛋白质会迅速富集到孔穴中以达到蛋白质的快速水解,同时又吸附固定磷酸化的多肤在其孔穴中,而非特异性的肤段被释放到溶液中。该方法简单、有效,己被成功应用于实际样品的检测。但以上方法存在一定的局限性,如修饰的金属氧化物不能完全覆盖硅基底材料,致使其富集过程受到影响。

  2。 2磁性纳米材料

  为了简单快速有效地实现分离富集,研究者又将具有磁性的铁氧化物材料引入其中。利用不同的铁氧化物表面包覆一层TiOZ或AlZ03,用于磷酸化肤段的富集并检测。研究表明,由于通过TiOZ包覆的磁性粒子对样品进行富集后,一些非磷酸化的肤段在谱线中出现,从而对磷酸化肤段的检测产生了干扰Czi —zzl,因此,AlZ 03包覆的磁性粒子对磷酸化肤的选择性优于TiOZ包覆的磁性粒子。在合成方法中,核壳技术也越来越多的引起人们的关注。X等利用水热反应首先合成了Fe 3 0、微球,随后通过葡萄糖的聚合作用和碳化作用使其表面包覆一层碳,制备了具有核壳结构的Fe304。在此基础上,制备了介孔核壳结构的磁性纳米复合物,应用于磷酸化多肤的分析中,具有高效、特异识别以及低分子肤段丢失量小的特点Czal 金属离子修饰的细菌性磁性纳米粒子(BMPs)可用于快速富集检测磷酸化的肤段。其中修饰的BMPs优先富集单磷酸化的肤段,而Zr4修饰的BMPs则优先富集多磷酸化的肤。 2013年,Wang等首次合成了磁性介孔纳米晶体簇,无需任何修饰直接用于磷酸化肤段的有效富集。该磁性介孔纳米晶体簇具有优秀的磁性响应(与之前的磁性复合物相比,磁性分离响应时间少于5s)、超高的选择性、较高的富集回收率(高于89。4% )、优秀的富集速度(10 min便可完全富集)等特点。该材料己成功应用于实际样品的检测。

  荧光方法因操作简单、易读、高产、样品量少等独特的优势,近年来在磷酸化富集检测中也有相关应用。制备Zr4功能化的磁性纳米粒子用于选择性捕获磷酸化的具有荧光标记的肤段,然后运用磁性分离富集,依据溶液中的荧光强度的改变,对磷酸化的肤段进行分析,利用该材料研究了在不同含量的药物刺激下,MCF 7细胞裂解液中蛋白激酶的表达水平。近期,Liu等制备了TiOZ修饰的磁性微球用于富集磷酸化的肤,与其它荧光方法相比,该材料展现出超高的荧光信号变化(S IN = 42 ),检出限低至0。 1U/mL。采用荧光方法结合磁性纳米材料富集目标多肤,具有灵敏度高、重现性好等优势,但同时也存在需要对底物进行较为复杂的荧光修饰等缺点。

  2。 3碳纳米材料

  在磷酸化多肤的富集过程中,早期主要用CIA硅胶柱和C — 60共价键合的二氧化硅进行预富集随后,碳微球因其良好的导电性、丰富的官能团和热力学稳定性等被广泛应用到磷酸化多肤的富集中。其中包括TiOZ功能化的胶质微球和TiOZ修饰的磁性石墨碳球等。

  近期,基于一维碳纳米材料碳纳米管和二维的石墨烯在磷酸化多肤的富集和分离方面的研究引起了广泛关注。Fang等首次将TiOZ—MWNT纳米复合物用于磷酸化多肤的富集和分离,该纳米复合物还成功应用于实际样品脱脂牛奶水解液中磷酸化多肤的富集。这主要归功于MWNT大的比表面积、易吸附疏水性物质和TiOZ与磷酸化多肤的专一作用。另外,两者的复合还避免了单一TiOZ纳米粒子的聚沉等问题。与碳纳米管相比,石墨烯是新发现的具有二维结构的材料,其共扼结构大、电子传输能力强、合成原料价格低廉等优势,使得石墨烯及其衍生物的应用研究成为热点。金属氧化物纳米粒子功能化的石墨烯复合物既结合了金属纳米粒子的特性又继承了石墨烯的优势,在磷酸化分析中具有很强的吸引力。但合成的碳纳米材料一金属亲和材料中,金属纳米材料的比表面积可能无单一纳米微球的比表面积大,致使其选择性不太理想。

  3基于纳米材料的信号放大作用

  高灵敏度在发展新型生物分析方法中己成为主要目标,为了满足对超灵敏生物传感器的需求和符合微型化生物分析的发展趋势,信号放大技术在近几年引起了人们的广泛关注。如,基于纳米材料的信号放大,基于酶的信号放大,以及基于核酸的信号放大技术等。在这些方法中,纳米材料因具有加快信号传导和提高位点的识别作用而在信号放大技术中得到广泛应用。本文主要综述了基于三类纳米材料的信号放大在蛋白磷酸化分析中的研究进展。

  3。 1基于金属纳米粒子

  金属纳米粒子因具有良好的光学、电化学和催化特性,己成为生物传感器中一类很有吸引力的材料,近年来对于金属纳米材料的研究也在不断地推进。其中基于金纳米粒子和银纳米粒子的信号放大在蛋白磷酸化分析方面效果尤为显著。

  AuNPs的合成非常简单,用氯金酸作还原剂,在快速搅拌的条件下可合成粒径大小均一的Au纳米粒子,形成稳定分散的胶体溶液。合成的AuNPs具有很多良好的特性,在蛋白磷酸化分析中可直接用于信号放大。Kim等用半肌氨酸修饰的多肤与AuNP、共价键合,使多肤固定在AuNP、的表面,利用AuNPs既可作目标分子富集器,又可作信号增强器的特性,采用二次离子质谱成像法成功地用于蛋白激酶活性的无标记分析。Kerman等利用生物素与亲和素的专一作用将AuNP、组装到电极上,以AuNPs为标记并通过其氧化还原信号实现磷酸激酶活性的分析。随后,该研究组又利用AuNPs与琉基化的磷酸根的专一作用将其组装到电极表面,用于蛋白磷酸化的分析。以上方法简单、直接、易实现,但因为只是利用金纳米粒子本身的电学特性实现蛋白激酶的检测,使得检测的灵敏度不够高。本研究组设计了一种新型高灵敏电化学发光(ECL)生物传感器,利用AuNPs作为信号传导探针催化鲁米诺电化学发光反应,显著增强鲁米诺的ECL信号,实现了蛋白激酶的高灵敏检测,同时该方法还有效避免了ECL反应中强氧化剂的使用,具有很好的稳定性。

  AuNPs大的比表面积,良好的生物相容性,易与琉基或其他生物配体结合的性质使其成为很好的载体,信号分子或其它活性物质在其表面可实现信号的放大。利用功能化的AuNPs作为信号分子的载体,在其上,错离子同时与磷酸化的多肤连接。基于静电作用,该载体可吸附大量带正电荷的,故可通过检测 (NH3)电量的变化实现蛋白磷酸激酶的高灵敏检测回。在上述研究基础上。将负载信号分子的过程简化,直接将功能化的AuNP、通过共价键合的方法负载半肌氨酸修饰,构建了一种新颖的电化学发光生物传感器用于蛋白磷酸化的高灵敏检测。以上方法很大程度提高了检测的灵敏度,但因为可溶性的电活性物质的引入,使得背景信号也升高。Wang等为了避免运用可溶性的电活性物质产生的较高背景,减小信噪比,将AuNP、负载大量的辣根过氧化酶(HRP)及亲和素,利用生物专一性作用将辣根过氧化酶固定在电极上。HRP可催化联苯胺的氧化,产生电化学信号,经AuNPs放大后电化学信号可用于磷酸化作用的检测。与之前的报道相比,该传感器的检出限低两个数量级。目前,本研究组仍致力于功能化的AuNPs信号放大体系用于蛋白激酶的活性检测及其抑制剂的研究:第一个体系主要是利用AuNPs—DNA中DNA的杂交技术形成网状大结构作为载体,负载丰富的电活性物质,以实现电信号的显著增强;第二个体系是构建一个双信号放大的生物传感器,结合电化学发光技术高的灵敏性,一方面利用AuNPs催化放大鲁米诺的电化学发光信号,另一方面通过AuNPs表面负载的多酶催化葡萄糖产生双氧水,间接催化放大ECL信号,实现高灵敏检测的目的。

  AgNPs的信号放大作用在灵敏检测磷酸化的肤段中也有相关应用。利用T102纳米粒子既可充当磷酸基团特异性键合的键合剂,又可充当感光剂的优势,在紫外照射下,使得Ag+光催化还原为AgNPs沉积在Ti02纳米粒子的表面以实现信号增强,从而构建一种灵敏检测蛋白激酶活性的生物传感器。Li等用AuNPs作信标,利用共振光散射法对实际样品不同细胞裂解液中蛋白激酶的活性进行检测,并对不同细胞的酶的活性表达水平进行了比较。因为AuNPs的共振光散射强度较弱,因此引入沉积的AgNPs可以增强检测的信号强度,提高检测灵敏度。

  3。 2基于量子点

  量子点是具有纳米尺寸的半导体晶体,因具有独特的光学、电学和电化学性质,目前己成为生物识别和生物传感过程中一类理想材料。基于QDs的发射波长可随其尺寸和形态自由调整的特点,可将其作为荧光探针应用于DNA检测、免疫分析、蛋白质分析尤其是蛋白激酶活性分析。

  设计了一种基于量子点一蛋白质的生物扼合物,利用荧光共振能量转移的方法检测蛋白激酶活性。其中,受体修饰在抗磷酸化肤的抗体上,量子点作为荧光能量转移的供体,当肤段发生磷酸化后,受体和供体便可近距离接触,发生能量共振转移,以增强受体荧光强度。在一定范围内,磷酸化的程度越高,在670 nm的荧光强度就越高。以上方法是利用量子点可作电子或能量的供体来实现蛋白激酶活性的灵敏检测。但这些方法都需要将多肤束缚在量子点的表面以使得供体和受体尽可能靠近,以达到能量或电子转移的目的,方法存在较大的局限性。

  在电化学检测方法上,基于QDs的信号放大在蛋白磷酸化分析中的应用报道较少。Pin—wattan。等Cool设计了一种基于CdSe/ZnS QD、的电化学免疫传感器,用于磷酸化的牛血清蛋白的分析检测。在该夹心型免疫传感中,QDs既用于电化学信号放大,又用于连接抗磷酸化络氨酸抗体。另外,由于多种类型QDs具有电致发光的特性,表面可通过配位或聚合物修饰等方式连接有机分子或生物大分子,基于QDs的电化学发光生物传感器有望成功应用到蛋白磷酸化的分析中。但QDs属于半导体材料,其导电性略差。

  3。 3其它纳米材料除了AuNPs和QDs之外,其它类型纳米粒子在蛋白磷酸化分析中也有应用。碳纳米材料因其良好的导电性和大的比表面积可作为纳米载体负载多酶、信标等,也可很好地实现蛋白磷酸化分析的信号放大。Du等利用石墨烯氧化物(GO)作为纳米载体负载大量的HRP和二抗,设计了一种新型的电化学免疫传感用于磷酸化蛋白的超灵敏检测。随后,研制出一种基于石墨烯的电化学免疫传感器。石墨烯作为传感平台不仅加快了电子传递而且增加了表面积以捕获更多,导致检测灵敏度显著增强。另外,Chen等基于Zr4+与磷酸根的强配位作用作为信号转换器,利用磷酸根修饰的介孔硅包埋作为信号放大器,构建了一种灵敏、简单、无标记的电化学发光传感器,用于蛋白激酶的活性分析。

  4结论与展望

  蛋白磷酸化分析经过几十年的发展,在灵敏检测、选择性富集方面取得了很大的进展。本综述在纳米材料的富集方面主要涉及介孔纳米材料、磁性纳米材料和碳纳米材料,分析了这些材料在磷酸化多肤或蛋白富集方面的优缺点以及改进之处。在基于纳米材料的信号放大方面,主要涉及金属纳米粒子和量子点以及碳材料等。优点是结合纳米材料和信号放大技术可很好地实现蛋白激酶的快速、高灵敏和选择性检测。缺点是过程操作相对复杂、需多步组装、在磷酸化的多肤和信号放大部分经常需要加入额外的链接剂(如抗原抗体、生物素亲和素以及亲和性的金属离子或氧化物)。

  在未来的研究中可能主要围绕以下方面开展:

  ①除了常见的电化学方法、质谱法、荧光法外,还可以尝试运用新的方法检测蛋白激酶活性(如光电化学法)。因为量子点均具有发光特性,在合适的激发光的刺激下发生跃迁可产生电流Coal,在磷酸化分析方面存在潜在的应用。

  ②目前,虽然对于蛋白磷酸化的研究层出不穷,但实际应用却比较少,因此,致力于实际样品的检测应是今后的努力方向。

  ③寻找新的材料。尤其是具有选择性识别或捕获磷酸化肤或蛋白的纳米材料,以简化蛋白磷酸化分析的过程。例如,目前最新发展起来的MOFs材料在磷酸化分析方面很有应用价值,因为其本身的金属离子可识别磷酸化的多肤,而孔洞结构、大的比表面积以及易于修饰的能力使得该材料可以作为信号放大的良好载体或是作为富集器,在复杂生物体中选择性富集磷酸化多肤。

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