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论p120ctn 亚型肺癌免疫荧光表达及意义
作为连环素家族的新成员，在细胞黏附和信号转导中起着至关重要的作用 [1-4]。
它的基因有21 个外显子，根据其剪切的不同，理论上p120ctn 可产生32 个亚型，所有的亚型都具有相同的犰狳(Armadillo)重复序列，只是C 端或N 端不同[5]。根据其起始翻译密码的不同人类的p120ctn 可分为4 种亚型，但各亚型的生物学功能至今尚未阐明[6,7]。目前在人肺癌中的研究很少，其在肺癌中表达的亚型种类及表达情况仍不清楚。本研究采用免疫荧光和Western Blot 方法，观察了p120ctn 及其各亚型在肺鳞癌、腺癌中的表达及意义，并探讨其与肺癌的临床病理因素的关系。
材料与方法材料例原发性肺癌及对应癌旁正常肺组织来自2003 年11 月至2004 年9 月在中国医科大学第一附属医院行外科手术切除的新鲜标本。 患者术前均未接受过放化疗。标本取出后立即放入-70℃冰箱保存备用。其中男37 例，女13 例，平均年龄59 岁（32-78 岁）。按年WHO 肺肿瘤组织学分类标准[8]，鳞癌15 例，腺癌35 例；高分化12 例，中分化23 例，低分化15 例；有淋巴结转移22 例，无淋巴结转移28 例。依据国际抗癌联盟(UICC)1999 年修订的肺癌p-TNM 分期标准[9] ：Ⅰ期13 例，Ⅱ期10 例，Ⅲ期27 例。
方法冰冻组织切片和免疫荧光染色观察取新鲜肺癌和癌旁正常肺组织标本 OCT 包埋，快速冷冻后制成5μm 厚的切片，贴附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，冷丙酮固定10min 后晾干备用。
固定后的冰冻组织切片用0.2% Triton X-100 处理15min。正常非免疫动物血清37℃孵育30min。滴加p120ctn 鼠抗人单克隆抗体（1:400，BD Transduction Laboratories），4℃孵育过夜。磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，每次5min，重复三次。滴加罗丹明标记羊抗鼠荧光标记二抗（1:200，北京中杉），37℃孵育30 分钟。PBS 冲洗，每次5min，重复三次。DAPI (1:200，SIGMA 公司)核复染30min；PBS 冲洗；50%甘油封片，荧光显微镜于波长为527nm 处观察罗丹明荧光强度,于372nm 波长处观察DAPI 的荧光染色,确定p120ctn 的表达及定位。
从新鲜肺癌和癌旁正常肺组织标本中取0.125cm3 左右大小的组织块，加入500μL 裂解液中冰浴下匀浆，4℃静置24h，低温高速离心（4℃、13000 转/分、30min），收集上清。中国硕士论文网为您提供公共管理硕士论文。
用考马斯亮兰法，以牛血清蛋白作为标准进行蛋白定量，计算各样品蛋白浓度。
将含 50μg 总蛋白的组织裂解产物进行SDS-PAGE 电泳1.5h 后，转印至PVDF 膜（100V，），5%脱脂奶粉室温封闭1h，经TTBS（20mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL，）冲洗3 次，抗p120ctn 单克隆抗体（1：400，BD Transduction Laboratories）4℃孵育过夜后，辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育1h，TTBS 洗三次后DAB 显色。以β为内对照，用凝胶成像分析系统（Biolmaging Systems,美国）测定p120ctn 各条带灰度值，并取其与β-actin 的比值为相对表达量分析p120ctn 各亚型的表达情况。
统计分析利用 SPSS for Window 11.5 进行统计分析。p120ctn 及其亚型在正常支气管上皮和癌中表达的关系采用Wilcoxon 符号检验, p120ctn 及其亚型表达与临床病理因素的关系采用秩相关检验，P＜0.05 有统计学意义。
结果免疫荧光结果在癌旁正常肺组织中的支气管上皮细胞胞膜上强表达，呈现完整、连续的红色强荧光，而在肺癌细胞中p120ctn 的膜荧光表达明显减弱，呈现不连续或缺失，并可出现胞浆表达（图1）。
结果参照预染蛋白分子量标准（赛百盛，北京，中国），在癌旁正常肺组织可见100KDa 和附近有特异性的条带，对应位置相当于p120ctn 的亚型1(120KDa)和3(100KDa)，而在肺癌组织中亚型1 和3（尤其是亚型1）多表现为缺失或减弱（图2）。
对Western Blot 图像结果的分析表明，包括1 和3 亚型在内的p120ctn 总蛋白在癌旁正常肺组织中的表达明显高于肺癌组织(P＜0.001，n=50)。p120ctn 的亚型1 和亚型3 在癌组织中的表达均有不同程度的缺失或减弱（P=0.001，n=50；P＜0.001，n=50)。亚型1 的缺失与各临床病理因素无关,而亚型3 的表达缺失与淋巴结转移呈负相关（P=0.005，n=50，r=0.397），与其他临床病理因素无关（表1）。
讨论我们以往的研究 [10-12]显示p120ctn 在正常肺组织中，主要以细胞膜表达为主，而在肺癌组织中则出现细胞膜表达下降，并伴有细胞浆或细胞核表达。我们应用免疫荧光法观察其在组织冰冻切片中的表达，其结果与我们以往的研究和在其它肿瘤中的报道[13-17]相似。在正常的肺组织中，p120ctn 于胞浆近胞膜域参与上皮钙黏素（E-cadherin）复合体的组成，进而稳定细胞间的黏附，因而我们观察到p120ctn 在细胞膜上呈完整、连续的较强的红色荧光；而在肺癌组织中，p120ctn 的膜表达减弱，出现荧光的不连续或缺失。这可能是由于肿瘤细胞中的p120ctn 从E-cadherin 复合体中解离出来的结果，这一结果可破坏细胞间的黏附功能，从而利于肿瘤细胞的侵袭和转移。脱离了复合体的p120ctn 可转向胞浆内，所以我们可以在细胞浆内可以检测到它的蓄积。
目前，p120ctn 在细胞黏附过程中的确切作用机制存在着很大争议[18,19]，其中原因之一就是由于p120ctn 具有多种亚型的存在，并且这些亚型的表达具有组织特异性[19-21]。
理论上，根据剪切不同，人类的p120ctn 可以产生32 种亚型，而且在不同的组织和细胞类型中p120ctn 亚型的剪切方式是不同的。根据起始翻译密码ATG 在N-端的不同位置，可分为亚型1-4，根据外显子A、B、C 在C-端不同应用又可将这四种亚型分为多种次亚型。
由于这些剪切方式只影响到N-端和C-端，其间的犰狳重复序列并未受到干扰，因而，它可以保持完整结构从而与E-cadherin 相连[18,19]。通过这种结合方式，p120ctn 的各种亚型都可以与E-cadherin 结合，进而对E-cadherin 复合体介导的细胞黏附进行调节。但关于p120ctn 各亚型的具体生物学功能及确切作用机制至今仍不清楚。尽管在人类正常组织中，可检测到四种p120ctn 亚型[20]，但我们检测了癌旁正常肺组织后发现，只在120KD 和100KD 处检测到两条特异性的条带，对应其位置相当于p120ctn 的1、3 两种亚型，并没有检测到明确的和4 亚型的表达。这一结果提示，p120ctn 亚型1 和亚型3 在肺组织内有较好的特异性表达。
与癌旁正常肺组织相比，肺癌组织中p120ctn 总蛋白的表达量明显减少，这与Skoudy 等人在结直肠癌中研究的结果类似。但是，p120ctn 总蛋白的表达与肺癌组织的分期、分化等临床病理因素并无任何相关性。为了深入探究p120ctn 在肺癌组织中的亚型表达及其意义。我们分别对p120ctn 亚型1、3 的表达量进行统计分析，结果表明：肺癌组织中亚型1 的表达量明显低于它在癌旁正常肺组织中的表达量，但是，我们没有检测到它的表达与各临床病理因素相关。亚型3 在癌组织中表达也明显低于正常肺组织，与亚型1 不同的是,亚型3 的减少没有亚型1 明显，而且它的表达缺失与淋巴结转移呈负相关，与其它各临床病理因素无关。从结果我们可以得出这样的推论：p120ctn 亚型1 与亚型3 可能是肺组织中主要表达的亚型，它们的表达可能与肺癌细胞的恶性程度有关，而且，这两种亚型对癌细胞恶性表型的影响可能也是不同的。从统计结果可以看出：在分化程度较好，无淋巴结转移的癌组织中，亚型3 的缺失较多。也就是说，亚型3 很可能会有促进癌细胞向恶性表型转化的作用，而亚型1 的作用并不明显。
从我们的实验结果可以看出，在癌旁正常肺组织中p120ctn 主要以亚型1 和亚型3 的表达为主，在肺癌组织中这两种亚型可以出现不同程度的缺失或减弱。并且它们各自的缺失程度可能对癌细胞的恶性表型有不同的影响：亚型1 的表达缺失可能会促进癌细胞的恶性表型，而亚型3 的表达缺失很可能会抑制癌细胞的恶性表型。那么在肺癌组织中，p120ctn 浆表达是否与亚型3 的表达具有一致性呢？亚型1 和3 的表达在影响癌细胞恶性表型方面究竟怎样发挥各自的生物学功能呢？这些还需要我们去做更深层的研讨。
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